淺談分子生物學工具於神經解剖的近來突破及應用

圖片來源：Pollock JD, Wu D-Y, Satterlee JS. Molecular neuroanatomy: a generation of progress. Trends Neurosci. 2014;37(2):106–23. doi:10.1016/j.tins.2013.11.001.
背景：從 Cajal 到 Connectome
人腦估計約有1000億個神經元，兩萬多個人類基因中，神經元表現其中的80% ¹，種類成百上千，兼有各種形態。縱橫交錯的神經網絡，掌控生理功能、運動、感覺、反射及思考，可說是人體最複雜而且迷人的器官。剖析複雜神經路徑如何調控這些生理功能，一直是神經科學家最大的挑戰和目標，即便今天，我們仍對大部份的神經元運作的功能所知有限。
十九二十世紀之交，神經科學的祖師爺Cajal 以銀染法(Golgi’s stain)，在光學顯微鏡下，一筆一筆描繪出神經系統中各種不同樣貌的神經元，開啓了神經解剖的濫觴²。 1970年代發現了可跨越突觸的neural tracers，使神經科學家得以找出神經傳導的路徑，也開啟了神經解剖學的黃金時代。然而，過去的神經路徑追蹤方法可以標定特定區域之突觸前或突觸後神經元之位置，卻有幾個主要的限制1. 在注射部位的各種神經元都會提取這些tracer，並不具特異性2. 僅知道突觸前與突觸後神經元的解剖位置，但無法得知其分子表現特徵。也因此分類神經細胞、剖析其路徑及功能一直是重要但困難的問題。

近年來分子生物學蓬勃發展，這個難題也在科學家發展出許多cell type-specific之基因工具下逐步得到解決。例如利用Cre-Lox、Flp-FRT、Gal4/UAS 等系統^1,³，使我們能選擇性操弄特定種類的神經元的基因表現。以最常見的Cre-Lox 系統為例，目前常用的方法之一是使用轉殖基因動物(transgenic animals)，選擇性地表現Cre recombinase 在想要操縱的神經元上 (例如GAD67為GABAergic neurons的細胞標記；GAD67-Cre transgenic animals僅會選擇性在GABAergic neurons上表現Cre recombinase)，再利用病毒載體( adeno-associated virus， lentivirus等)感染神經細胞，提供含有Lox 序列的DNA序列以供Cre編輯。如圖1所示，Cre會依兩段Lox序列的方向，以不同方式編輯兩段Lox序列中間的DNA序列。因為Cre-dependent gene editing只有在表現Cre recombinase 的該種神經元才會發生，我們可以利用此系統選擇性在該類神經元表現，或剔除特定的分子。

圖1. Cre-Lox 系統的作用方式 (From http://cre.jax.org/introduction.html)

以下，我將簡介近來利用Cre- Lox 系統衍生之基因工具。
以選擇性破壞，optogenetics及chemogenetics方法探索特定神經元的功能
同一解剖位置，往往混雜各種不同種類的神經元，自別處投射來的軸突，或是通過此處的神經纖維束等不同組織。因此，單純的電刺激或藥物，幾乎都難以專一地操弄特定種類神經元而不影響到其他組織。2005年optogenetics的出現，得以選擇性的操弄單一種類的神經元，使得這個難題終於得以突破。神經科學家開始利用這個利器，尋找各類神經元在動物行為中扮演的角色。近年來分子生物學工具突飛猛進，類似chemogenetics 與選擇性破壞(ablation) 等擁有細胞種類專一性，以不同方式操弄神經元的方法，現在也逐漸成熟而廣泛使用於神經科學研究中。
欲篩選特定種類神經元的功能，我們可以使用Cre-Lox system 選擇性破壞特定種類的神經元，並觀察破壞後的效應。例如在這些神經元選擇性表現Caspase3 啓動細胞自戕(apoptosis)⁴；或是表現白喉毒素(diphtheria toxin)受器⁵，可被注射之白喉毒素選擇性毒殺等方式。選擇性破壞方法能讓我們快速探索特定神經元的未知功能，亦可以觀察到破壞後長期的效應，但是破壞後神經網路可能產生補償性機制(compensatory mechanism)掩蓋後續的變化，是研究時必須留意的重點。
我們亦可用optogenetics ⁶ 及chemogenetics (例如DREADD，designer drug exclusively activated by designer drug ⁷)等方式，在行為測試中選擇性地刺激和抑制特定種類的神經元。 Optogenetics利用特定波長的光活化光敏感之離子通道或幫浦，產生電流活化或抑制神經細胞 (圖2)。 DREADD則是利用改造後的human muscarinic receptor (G protein-couple receptor)對於clozapine-N-oxide (CNO)的高親和力，可藉由注射CNO射活化GPCR下游的訊息傳遞路徑來刺激或抑制神經元 (圖3) 。這些刺激方法提供了在行為實驗中可逆而快速操弄特定神經路徑的好處。

圖2. 各種不同的Rhodopsins. ( From Pollock et al 2014)

圖3. Excitatory/Inhibitory DREADD (From Pollock et al 2014)

利用病毒載體進行特定種類神經元的路徑追蹤

過去的neuron tracers能夠標記注射區域的突觸前與突觸後神經元，但無法針對單一種類的神經元追蹤。而且可能跨越多個突觸，使得神經路徑上的神經元皆同時被標記。目前神經科學家利用Cre-Lox system及改造後的各種病毒作為新一代的genetic tracer，專一性地標定特定種類的神經元以改進這些問題。
Anterograde tracing:
目前可以使用許多策略選擇性尋找單種神經元突觸後神經元的位置，例如利用往軸突方向運輸、可跨越突觸的病毒HSV1 H129 strain⁸，或是利用改造突觸前分子synaptophysin，以synaptophysin-XFP融合分子標記 presynaptic bouton，找出突觸後神經元的位置⁹。甚至亦可利用channelrhodopsin 2-XFP的高表現量尋找軸突的投射方向¹⁰。
Retrograde tracing:
目前可利用Cre-lox 系統與改造之狂犬病毒(rabies virus)進行只跨越單突觸，專一種類神經細胞的追蹤^11,¹²。如圖所示，先利用AAV將mCherry，TVA和glycoprotein G選擇性表現在欲追蹤的細胞上，再注射缺乏glycoprotein G的改造狂犬病毒(其膜蛋白只能與TVA結合，因此只能感染TVA(+)神經元) 。當狂犬病毒傳播至突觸前神經元時，即會因為突觸前神經元缺乏glycoprotein G而無法繼續傳播。而狂犬病毒本身攜帶EGFP，所以起始族群會呈現黃色(EGFP+mCherry)，而突觸前神經元會呈現綠色(EGFP) (圖4)。

圖4. Monosynaptic, cell type-specific retrograde tracing by engineered rabies virus.¹⁸

除了解剖位置之外，我們要如何得知神經路徑上的神經元種類呢？下面介紹的TRAP技術可以幫的上忙。
以TRAP技術分析特定神經元之轉錄體 (Transcriptome)
近年來核酸定序技術突飛猛進，完整分析細胞之轉錄體已非難事。然而，各種不同種類的神經元在腦中往往彼此混雜而無法分離；再者，受到外界刺激後，不同種神經細胞的轉錄體變化亦隨之各異。那麼，有無方法能選擇性分析單種神經元的轉錄體，以高效率的方式找出該類神經元的分子特徵，例如細胞標記，共同表現的分子以及轉錄體受到刺激後的變化呢？
TRAP (Translating ribosome affinity purification)是近來發展，利用磁珠連結核糖體抗體將核糖體免疫沉積，進而分析核糖體上轉錄中之mRNA的技術¹³ (此過程稱之為ribosome profiling) 。相較於分析total mRNA，ribosome profiling的數據更能代表細胞內蛋白質的表現程度¹⁴。
在此基礎之上，我們可以使用Cre-Lox system，在指定種類的神經元中，選擇性表現EGFP與核糖體 subunit L10的融合分子 (EGFP-L10 fusion molecule)，再利用EGFP 抗體TRAP帶有EGFP-L10的核糖體¹⁵(圖5)。因為只有該類神經元在核糖體上表現此融合分子，ribosome profiling的結果僅含有該種神經元的轉錄體，可達到很高的專一性。
此外，我們可利用TRAP 分析活化的神經元之轉錄體。神經元活化時，核糖體的s6 subunit會被磷酸化(phosphorylated S6 subunit， S6)¹⁶。因此，可使動物進行行為測試，再利用pS6 抗體TRAP這些活化神經元中磷酸化的核糖體。原則上，得到的mRNA profile是活化神經元轉錄體的加權總和。若A類神經元在此行為中普遍被活化，我們可發現A類神經元專屬的mRNA會上升，反之則下降。我們可以利用此點篩選在特定行為中活化的神經種類。
目前亦可利用Rabies virus等跨越突觸的病毒TRAP突觸前神經元的轉錄體¹⁷。

圖5. TRAP EGFP-L10-ribosome by anti-EGFP-coated magnetic bead, Green: EGFP-L10.¹⁵

其他的進展

其他如將神經元繪上不同顏色的Brainbow、令腦組織透明的CLARITY 等技術加快我們剖析Connectome的腳步。GCaMP (genetically encoded calcium indicator) 可讓我們in vivo觀察行為測試中特定神經元的鈣離子訊號，提供直接的相關性證據。CRISPR 等基因體編輯工具不僅大幅加快了制作基因改造動物的速率，也為未來解析神經網路的方法提供更多可能性。
結語
近二十年來，分子生物學的應用為神經科學帶來許多重大突破。將各種神經元分類，剖析及路徑並對應其功能，是需要科學家們通力合作的浩大系統工程，更是我們探索心智哲學的研究基石。美國政府日前盛大推出的Brain initiative 計劃正是意在解析這些複雜神經網路的奧祕。目前大部份腦區的分子表現及投射已有許多資料庫以供查詢，例如Allen brain atlas及GENSAT¹等可供公眾存取的網路資料庫。這些資源均提供了研究者探索神經網路的重要基礎。
參考資料

Pollock JD, Wu D-Y, Satterlee JS. Molecular neuroanatomy: a generation of progress. Trends Neurosci. 2014;37(2):106–23. doi:10.1016/j.tins.2013.11.001.
Jones EG. Neuroanatomy: Cajal and after Cajal. Brain Res Rev. 2007;55(2):248–55. doi:10.1016/j.brainresrev.2007.06.001
Luo L, Callaway EM, Svoboda K. Genetic dissection of neural circuits. Neuron. 2008;57(5):634–60. doi:10.1016/j.neuron.2008.01.002.
Yang CF, Chiang MC, Gray DC, et al. Sexually dimorphic neurons in the ventromedial hypothalamus govern mating in both sexes and aggression in males. Cell. 2013;153(4):896–909. doi:10.1016/j.cell.2013.04.017.
Han J-H, Kushner SA, Yiu AP, et al. Selective Erasure of a Fear Memory. 2009;323(March):1492–1496.
Boyden ES, Zhang F, Bamberg E, Nagel G, Deisseroth K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 2005;8(9):1263–8. doi:10.1038/nn1525.
Alexander GM, Rogan SC, Abbas AI, et al. Remote control of neuronal activity in transgenic mice expressing evolved G protein-coupled receptors. Neuron. 2009;63(1):27–39. doi:10.1016/j.neuron.2009.06.014.
Lo L, Anderson DJ. A Cre-dependent, anterograde transsynaptic viral tracer for mapping output pathways of genetically marked neurons. Neuron. 2011;72(6):938–50. doi:10.1016/j.neuron.2011.12.002.
Xu W, Südhof TC. A neural circuit for memory specificity and generalization. Science. 2013;339(6125):1290–5. doi:10.1126/science.1229534.
Saito YC, Tsujino N, Hasegawa E, et al. GABAergic neurons in the preoptic area send direct inhibitory projections to orexin neurons. Front Neural Circuits. 2013;7(December):192. doi:10.3389/fncir.2013.00192.
Wickersham IR, Lyon DC, Barnard RJO, et al. Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons. Neuron. 2007;53(5):639–47. doi:10.1016/j.neuron.2007.01.033.
Watabe-Uchida M, Zhu L, Ogawa SK, Vamanrao A, Uchida N. Whole-brain mapping of direct inputs to midbrain dopamine neurons. Neuron. 2012;74(5):858–73. doi:10.1016/j.neuron.2012.03.017.
Ingolia NT, Ghaemmaghami S, Newman JRS, Weissman JS. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 2009;324(5924):218–23. doi:10.1126/science.1168978.
Ingolia NT. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nat Rev Genet. 2014;15(3):205–13. doi:10.1038/nrg3645.
Heiman M, Schaefer A, Gong S, et al. A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types. Cell. 2008;135(4):738–48. doi:10.1016/j.cell.2008.10.028.
Knight Z a, Tan K, Birsoy K, et al. Molecular profiling of activated neurons by phosphorylated ribosome capture. Cell. 2012;151(5):1126–37. doi:10.1016/j.cell.2012.10.039.
Ekstrand MI, Nectow AR, Knight Z a, Latcha KN, Pomeranz LE, Friedman JM. Molecular profiling of neurons based on connectivity. Cell. 2014;157(5):1230–42. doi:10.1016/j.cell.2014.03.059.
Arenkiel BR, Ehlers MD. Molecular genetics and imaging technologies for circuit-based neuroanatomy. Nature. 2009;461(7266):900–7. doi:10.1038/nature08536.