長時間的活細胞影像技術對於監測細胞內的生理活動及形態十分重要，現今常用的顯微術之一為螢光顯微術，需要以螢光染劑標記特定的細胞構造，但激發螢光染劑時可能對細胞造成光傷害 [1]，且染劑可能會有光漂白（photobleaching）的現象 [註 1] 發生，影響長時間的活細胞拍攝。除了螢光顯微鏡外，近年也發展出許多無標記（label-free）的顯微術，其一為紅外光顯微術（infrared （IR） microscopy）紅外光會造成樣本中的分子振動（vibration），不同的分子，例如蛋白質、脂質會具有不同的紅外光吸收峰，藉由量測樣本不同區域的吸收光譜，即可得出樣本中不同生化分子的分佈影像（biomedical images），然而紅外光顯微鏡的空間解析度較低，無法觀測尺寸較小的細胞構造。
中紅外光譜光熱顯微鏡（mid-infrared photothermal (MIP) microscopy）是基於紅外光對樣本產生的光熱效應所開發的顯微術 [2] 。MIP 顯微鏡的儀器架設是由中紅外量子級聯雷射（quantum cascade laser）及一個可見光光源組成（圖一） ，紅外光會激發生物樣本內的分子使其到達振動態並釋放熱能，使周圍溫度上升並造成折射率梯度（refractive index gradient），形成光熱對比（photothermal contrast），而此時另一個可見光光束通過時便會產生散射，折射率越高，光的散射角越大，因此藉由光的散射可以反應環境溫度的變化，且因為可見光的波長較短，故空間解析度可較紅外光顯微鏡高。
圖一、中紅外光熱顯微鏡儀器成像示意圖
（OAPM: off-axis parabolic mirror; M: mirror; L: lens; DM: dichroic mirror; OBJ: objective; PD: photodiode)
圖片來源：https://doi.org/10.1021/acs.jpclett.9b00616
MIP 顯影技術不需要另外加入任何外源性物質作為標記，因此可以避開利用外源性物質標記時螢光物質所產生的細胞毒性及光漂白等問題。此篇研究首度利用 MIP 顯影技術觀測細胞質內蛋白的分布，不僅提供了神經膠質細胞及神經細胞的動態影像，也展示了軸突經由細胞骨架運輸神經傳導物質的過程。
圖二、寡突膠質細胞的（a）亮視野顯微鏡（bright-field）和（b）MIP 顯微鏡成像圖。（c）每五分鐘追蹤（b）框選區域細胞有絲分裂過程的 MIP 影像（d）寡突膠質細胞本體 MIP 影像的總體積分信號（total integrated signal）（e）細胞於一般狀態、有絲分裂中期、與細胞質分裂的 MIP 影像。
圖片來源：https://doi.org/10.1021/acs.jpclett.9b00616
比較寡突膠質細胞（oligodendrocyte）的亮視野顯微鏡（bright-field）和 MIP 顯微鏡（圖二），在亮視野顯微鏡下可觀察到細胞結構呈現出類似囊泡的形狀；在 MIP 成像中則因細胞內蛋白質分佈的差異而產生不同的光熱對比，可以明顯在細胞核中核仁的位置看到強烈的對比訊號。
為了進一步探討腦細胞生命週期的動態過程，研究團隊在五分鐘內拍攝一系列細胞影像，觀測細胞分裂的整個過程（圖二 c）。和常態下的細胞（圖二 b）相比，細胞分裂時寡突膠質細胞有更明顯的 MIP 訊號，從中也能觀測到細胞尺寸的改變及訊號強度的改變。此外，光熱成像提供了細胞內蛋白的濃度及分布的重要資訊，分析細胞有絲分裂時的整體訊號，可以發現在有絲分裂中期（metaphase）訊號強度高了約 1.37 倍（圖二 d）。
圖三、神經細胞的亮視野顯微鏡（bright-field）和 MIP 顯微鏡成像圖。
圖片來源：https://doi.org/10.1021/acs.jpclett.9b00616
團隊更進一步將 MIP 顯影應用於追蹤神經細胞從樹突（dendrite）傳送囊泡的過程（圖三），發現在神經細胞體質及軸突（soma and axon）有很高濃度的蛋白分布（圖三 b），而在樹突的訊號則相對弱了一些。從圖三 c 也可以觀察到蛋白含量較高的囊泡在軸突中運輸的過程，在神經樹突細胞中也有相同趨勢（圖三 e）。MIP 顯微鏡結合了紅光光譜對特定化學結構的靈敏性，並利用可見光光束進行成像，大幅提高了空間解析。由這些實驗展示了 MIP 顯微鏡在即時顯影及長時間成像上的優勢，在不外加其他外源性標記的情況下，可以很好地追蹤細胞內蛋白製造、聚集及運輸等過程。
註 1：光漂白現象（Photobleaching）是指螢光分子受太強激發光激發或是和環境中物質反應產生化學變化，使結構受到破壞而無法再放出螢光。
Main Article:
Lim, J. M.; Park, C.; Park, J.-S.; Kim, C.; Chon, B.; Cho, M. Cytoplasmic Protein Imaging with Mid-Infrared Photothermal Microscopy: Cellular Dynamics of Live Neurons and Oligodendrocytes. The Journal of Physical Chemistry Letters 2019, 10 (11), 2857–2861. https://doi.org/10.1021/acs.jpclett.9b00616
參考文獻：
[1] Magidson, V.; Khodjakov, A. Circumventing Photodamage in Live-Cell Microscopy. Methods in Cell Biology 2013, 545–560. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-407761-4.00023-3
[2] Adhikari, S.; Spaeth, P.; Kar, A.; Baaske, M. D.; Khatua, S.; Orrit, M. Photothermal Microscopy: Imaging the Optical Absorption of Single Nanoparticles and Single Molecules. ACS Nano 2020, 14 (12), 16414–16445. https://doi.org/10.1021/acsnano.0c07638
撰文｜Investigator 團隊
審稿｜解淮清、陳品萱
