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突破壁壘:結核桿菌造成的雙重膜損傷促使 NLRP3 活化且走向細胞焦亡

結核桿菌(Mycobacterium tuberculosis)感染一直是全球重要的健康議題,在世界衛生組織 2021 年發布的結核病報告中提到, 2019 年仍有約 140 萬人因感染結核桿菌死亡 [1]。

針對結核桿菌的感染機制,最近被發現和 IL-1β 有關。 IL-1β 是一種受感染時可保護宿主的細胞介素,當病原體活化使 NLRP3 發炎小體形成,發炎小體中的caspase-1 會自體活化並切斷 pro-IL-1β 、以及活化穿孔分子 GSDMD (pore-forming molecule gasdermin D),穿孔製造了 IL-1β 離開的間隙,也造成細胞死亡 [2]。而結核桿菌引起的發炎小體活化和 ESX-1(ESAT-6 secreting system 1)有關,它能分泌蛋白質分子來調節吞噬體(phagosome)的穿透性,影響結核桿菌在細胞質中的移動;另外,它也會促使 NLRP3 的觸發因子從受損的吞噬溶酶體(phagolysosomes)釋放(圖一)[3]。

圖一、結核桿菌的細胞感染機制。
圖片來源:https://doi.org/10.4049/jimmunol.1101457

來自挪威科技大學的研究團隊使用單細胞,希望能了解結核桿菌在吞噬體膜以外、於細胞膜造成的破壞會如何影響發炎小體活化與細胞焦亡[4]。

結核桿菌誘導 NLRP3 發炎小體活化

研究團隊假設結核桿菌會在入侵巨噬細胞時,誘導發炎小體 NLRP3 或 AIM2 與巨噬細胞結合。他們使用能表現帶有螢光 ASC 的巨噬細胞進行實驗,並以螢光染劑來衡量細胞死亡情況,從分析結果中可以發現:受結核桿菌侵襲的巨噬細胞會有ASC-speck 形成,而死亡細胞的數量與 ASC-speck 及 IL-1β 的分泌量會隨著感染複數(Multiplicity of infection, MOI)增加而上升(圖二)。

圖二、感染複數與死亡細胞量(左)、 ASC-speck(中)、 IL-1β 的分泌量(右)有正相關。
圖片來源:https://doi.org/10.1038/s41467-020-16143-6

吞噬體內的結核桿菌無法因自噬啟動而被有效清除

Galectin-3 (Gal-3)是一種存在於巨噬細胞中的蛋白質,當病原體被吞噬體吞納時,它能夠堆積在病原體周圍,並與吞噬體內側的醣化蛋白質鍵結,也被用作損傷的吞噬體之標記物[5]。

研究團隊想知道吞噬體的破裂如何影響細胞焦亡。比較有無結核桿菌感染的細胞,結果發現,受感染而焦亡之細胞內, Gal-3 的含量比未感染組多;其內的結核桿菌周圍會有 Gal-3 聚集,並暴露於宿主細胞的細胞質中, Gal-3 會被自噬體蛋白 LC3B 標記,並形成自噬體。然而,研究團隊發現吞噬體中只有 20% 的結核桿菌會被困在自噬體內,意味著這種方式無法有效阻隔結核桿菌的感染。

細胞焦亡後,結核桿菌持續擴散感染

細胞死亡會伴隨形態上的改變,所以也是掌握細胞死亡過程的方式之一。受結核桿菌感染的宿主有 3 種細胞死亡形式,包含被感染細胞會出現焦亡或壞死,而周邊未被感染者則有細胞凋亡情形。其中,細胞焦亡是結核桿菌感染後,24 小時內最主要發生的細胞死亡類型。

研究團隊比較了正常細胞與結核桿菌感染後發生焦亡的細胞,後者出現嚴重的超微結構損傷,像是細胞核膜變得支離破碎、細胞膜大範圍損傷,並造成細胞內的胞器流出。此外,研究團隊也觀察到約有四分之一的結核桿菌會隨著外流物而離開焦亡的細胞,剩餘的四分之三則會被周邊細胞吞噬,並活化新宿主細胞的發炎小體、引起細胞死亡。

結核桿菌會直接損傷細胞膜

目前還不確定細胞質膜的損傷是結核桿菌的直接作用,還是結核桿菌誘導內生性細胞死亡途徑後造成。為了監測細胞質膜的完整性,研究團隊使用細胞凋亡的相關蛋白 ALG-2 來定位細胞質膜受損的位置。在受感染的細胞中,有 90% 的 ALG-2 都聚集在結核桿菌附近,而巨噬細胞也出現相似情形。由此可知,無論是在巨噬細胞吞噬感染細胞前後,結核桿菌都能直接損傷細胞膜,是一條造成細胞死亡的導火線。

通過 Gal-3、ALG-2 的累積及 ASC-speck 的形成,研究團隊比較三者出現的先後,試圖了解吞噬體或細胞膜的損傷與活化發炎小體之間的關聯:代表細胞膜損傷的 ALG-2 在 ASC-speck 形成前出現得更頻繁(圖三),時序上也比指標吞噬體損傷的 Gal-3 更靠近 ASC-speck 的形成時機點(圖四)。

圖三、 帶有 Gal-3、ALG-2 的存活細胞與焦亡細胞的占比。在 ASC-speck 形成前 20 分鐘,發生焦亡的細胞中有 48% 的細胞有 ALG-2 ,23% 的細胞中有 Gal-3 ,意味著此時有較多的細胞發生細胞膜損傷。
圖片來源:https://doi.org/10.1038/s41467-020-16143-6

圖四、Gal-3、ALG-2 及 ASC-speck 的形成時序。
圖片來源:https://doi.org/10.1038/s41467-020-16143-6

為了確認細胞膜損傷與發炎小體活化的關聯性,研究團隊使用剔除了調節細胞膜修復因子 ALG-2 與 ALIX 的細胞與一般感染細胞進行比較。藉由前者引起更多發炎小體活化的結果,可以知道細胞膜損傷是發炎小體活化的誘導因子,若能修復細胞膜的受損,或能逃脫由結核桿菌引起的細胞的焦亡命運。

總結

從挪威科技大學的結核桿菌感染機制單細胞研究中,可以看到結核桿菌有不同的方法使其能夠從宿主巨噬細胞的防禦壁壘中逃脫,像是直接破壞細胞膜以啟動 NLRP3 發炎小體,造成細胞焦亡;在原先的宿主細胞死亡後,結核桿菌仍能繼續擴散,入侵鄰近細胞,造成更大範圍的感染。從研究中可以發現吞噬體的細胞膜可能是一道有效的防線,保持細胞膜的完整性或能控制結核桿菌的感染。

Main Article:

Beckwith, K. S., Beckwith, M. S., Ullmann, S., Sætra, R. S., Kim, H., Marstad, A., Åsberg, S. E., Strand, T. A., Haug, M., Niederweis, M., Stenmark, H. A., & Flo, T. H. (2020). Plasma membrane damage causes NLRP3 activation and pyroptosis during Mycobacterium tuberculosis infection. Nature communications, 11(1), 2270. https://doi.org/10.1038/s41467-020-16143-6

參考文獻:

  1. WHO 2021 World TB Day Campaign Materials https://www.who.int/campaigns/world-tb-day/world-tb-day-2021/campaign-materials
  2. Swanson, K. V., Deng, M., & Ting, J. P. (2019). The NLRP3 inflammasome: molecular activation and regulation to therapeutics. Nature reviews. Immunology, 19(8), 477–489. https://doi.org/10.1038/s41577-019-0165-0
  3. Abdallah, A. M., Bestebroer, J., Savage, N. D., de Punder, K., van Zon, M., Wilson, L., Korbee, C. J., van der Sar, A. M., Ottenhoff, T. H., van der Wel, N. N., Bitter, W., & Peters, P. J. (2011). Mycobacterial secretion systems ESX-1 and ESX-5 play distinct roles in host cell death and inflammasome activation. Journal of immunology (Baltimore, Md. : 1950), 187(9), 4744–4753. https://doi.org/10.4049/jimmunol.1101457
  4. Beckwith, K. S., Beckwith, M. S., Ullmann, S., Sætra, R. S., Kim, H., Marstad, A., Åsberg, S. E., Strand, T. A., Haug, M., Niederweis, M., Stenmark, H. A., & Flo, T. H. (2020). Plasma membrane damage causes NLRP3 activation and pyroptosis during Mycobacterium tuberculosis infection. Nature communications, 11(1), 2270. https://doi.org/10.1038/s41467-020-16143-6
  5. Paz, I., Sachse, M., Dupont, N., Mounier, J., Cederfur, C., Enninga, J., Leffler, H., Poirier, F., Prevost, M. C., Lafont, F., & Sansonetti, P. (2010). Galectin-3, a marker for vacuole lysis by invasive pathogens. Cellular microbiology, 12(4), 530–544. https://doi.org/10.1111/j.1462-5822.2009.01415.x

撰文|游霈柔
審稿|林潔芯

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Pei Jou, You

Pei Jou, You

希望能透過Investigator獲得生醫相關新知,以及為生醫資訊的傳播貢獻自己一份小小的力量。

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