#NEWS 單細胞多體學揭示多發性硬化症易感性基因表現的可能調控機制

多發性硬化症是嚴重的自體免疫疾病，由先前的全基因體關聯分析研究，已經找出兩百多個可增加疾病風險的基因。而瑞典 Karolinska Institutet 為首的團隊，針對多發性硬化症的免疫標的細胞 – 寡樹突膠細胞及其前驅細胞，進行單細胞染色質的開放程度、 RNA 定序及多體學的分析，探討表觀遺傳學調控機制如何影響其易感性基因的表現。團隊最後證實寡樹突膠細胞可經由調控基因表現，改變細胞本身的免疫狀態，並影響多發性硬化症的疾病進程。

GWAS 揭示多種疾病的遺傳風險

全基因體關聯分析（Genome-wide association study, GWAS）可用於比較患者與健康個體的單核苷酸多型性（single-nucleotide polymorphism, SNP）之間的差異，篩選出與疾病風險相關、且具有統計意義的 SNP；這些 SNP 位點上的序列變異，則可能調控基因表現或者改變蛋白質序列。自從 GWAS 問世的十五年來，在國內外團隊的努力下，一一揭開了第二型糖尿病、冠狀動脈疾病、克隆氏症（Crohn’s disease）等國人常見慢性病的相關風險基因。從先前的研究，已經發現兩百多個可增加多發性硬化症風險的 SNPs （susceptibility SNPs/genes，下稱『易感性基因/SNP』），通常坐落於免疫相關基因的上下游 [1]。

簡介多發性硬化症

多發性硬化症（Multiple sclerosis）是好發於二十到四十歲女性的自體免疫疾病。患者的免疫細胞攻擊中樞神經的寡樹突膠細胞（oligodendroglia, OLG），造成髓鞘受損，影響神經訊號的傳遞。其症狀為四肢痙攣、疼痛、認知障礙、消化及泌尿系統問題等，嚴重干擾患者的生活品質。然而，目前無法根治多發性硬化症，只能透過藥物控制，減緩症狀惡化 [2]。

研究寡樹突膠細胞在多發性硬化症中的角色

先前研究顯示，原本能夠協助修復髓鞘的 OPCs （寡樹突膠細胞前驅細胞，oligodendrocyte precursor cell），在疾病狀態下，功能與分化進程受到阻滯，甚至會轉為產生近似免疫細胞的特性，呈獻抗原給 T 淋巴球。

有別於過往自體免疫疾病研究大多聚焦於免疫系統如何攻擊細胞，以瑞典 Karolinska Institutet 為首的團隊，轉而研究受害的細胞──OLG 與其前驅細胞 OPC ，探討多發性硬化症易感性基因的表現機轉。

以單細胞分析技術檢視基因調控機轉

ATAC-seq （定序檢測轉位酶可及的染色質分析法，Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing）是一種偵測染色質開放程度（Chromatin accessibility, CA）的技術，透過特殊的轉錄因子（Transcription factors, TF）結合，分析染色質上有哪些區域處於開放可表現的狀態。至於 scATAC-seq（單細胞 ATAC-seq，single-cell ATAC-seq）則是結合流式細胞術（Flow cytometry），由細胞表面蛋白區分不同種類的細胞，再以 ATAC-seq 分析特定細胞的基因表現與分子調控機制 [3]。

本研究便是利用 scATAC-seq 與 scRNA-seq （單細胞 RNA 定序，single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）分析，以小鼠為模型，研究多發性硬化症和控制組的 OLG 與 OPC 在基因表現上的與其他神經膠細胞的差異，探討多發性硬化症易感性基因的調控路徑。

疾病狀態的基因表現及表觀遺傳記憶

比較多發性硬化症模式小鼠與控制組小鼠的 OLG，並針對鄰近染色質開放差異區域的基因進行功能分析，發現主要影響免疫作用相關的生物途徑。進一步檢視同時在 OPCs 與寡樹突膠細胞及微膠細胞（microglia）中皆為染色質開放區域的基因位點、與僅在個別細胞種類中染色質較為開放的基因，發現微膠細胞中活化的基因涉及的訊息傳導路徑主要為 IL6/JAK/STAT3 和 NF-κB/TNF-α，而成熟 OLG 與 OPC 中則是 IFN-γ and IFN-α 途徑相關基因受到誘導；然而一些染色質開放的基因只在 OPC 觀察到，成熟 OLG 則沒有，可見染色質調控也因發展階段而異。整體而言，比較病態與控制組的 OLG 的染色質開放差異區域，有 11.48% 位於啟動子。例如 MHC-1 基因座上的 TAP1/PSMB9 及 MHC-2 的促進性轉錄輔因子（transcriptional coactivator） Ciita，其染色質區域皆在病態小鼠 OPC 較開放。

值得一提的是，若 OPC 的易感性基因的啟動子被 IFN-γ 活化，即便往後並未繼續表現相關基因，在發展成熟後仍會呈現活化後的免疫狀態。由此可知，藉由環境中的細胞激素（如 IFN-γ）及細胞內部的轉錄前調控（如啟動子）活化免疫基因表現，能夠使 OPC 形成表觀遺傳學的記憶，對於未來發展成多發性硬化症具有深遠的影響。

多發性硬化症易感性基因分型

團隊將與多發性硬化症易感性相關的基因分為兩型，並比較 IFN-γ 處理後的差異：第一型是在疾病狀態下，會促進基因轉錄，同時增加染色質開放性；而第二型則只有增加基因表現，染色質開放性並未提升（表一、圖三）。這些基因所在的染色質，通常可同時受到抑制性與活化性的表觀遺傳調控，抑制性的訊號為組蛋白甲基化 H3K27me3，而活化的訊號包含 H3K4me3、H3K27ac [註一] 和 CCCTC 結合因子（CCCTC-binding factor）[註二] 標記轉錄活化。第一型基因平時多有 H3K4me3 修飾，IFN-γ 使 H3K27ac 和 CCCTC 結合因子增加、H3K27me3 標記減少，結果就是表現量提升。第二型基因平時受 H3K27me3 加 H3K4me3 共同調控，IFN-γ 處理後，雖然染色質開放性沒有顯著增加，但 H3K4me3、H3K27ac、CCCTC 結合因子三者同時提升，促進基因轉錄。

表一、第一型與第二型基因在 IFN-γ 處理後的差異

	染色質開放性	基因表現量
第一型基因	增加	增加
第二型基因	未增加	增加

人類大腦灰質組織表現二型多發性硬化症易感性基因的模式

團隊也在兩位健康的人類大腦灰質組織中，針對上述的第一型與第二型多發性硬化症易感性敏感性相關的基因（圖三），進行多體學（multi-omes）分析，同時探討染色質開放程度與基因表現情形，藉此了解人類腦部免疫基因中的染色質開放區域與小鼠模式中的現象有何異同。第一型基因多表現於微膠細胞，甚少表現於 OLG，此健康人類的情形類似小鼠的控制組。而第二型基因則廣泛表現於所有人類灰質組織，在不同細胞間沒有基因表現上的差異。

在人類的 OLG、OPC 及微膠細胞中，多發性硬化症易感性 SNPs 與染色質開放性提升的區域高度重疊。這些 SNPs 位於部分 MHC 基因座，例如 HLA-B、HLA-DQB1，不論人類或小鼠都可觀察到類似現象。然而，團隊也發現多個 MS 基因調控相關 SNPs 在 MS 小鼠具有比健康人類更高的染色質開放性，例如：H2-ab1 的啟動子、H2-eb1 的增強子、MHC-II 調控基因 Ciita 與 Socs1 等。顯示出特定調控機制相關 SNP 在 MS 患者較健康個體有明顯染色質開放性提升，而這可能就是影響 MS 發生的關鍵調控機轉。

IFN-γ 可調控多發性硬化症基因表現

最後，團隊在疾病模式小鼠 OPC 中加入 IFN-γ，成功調控 MS 易感性 SNPs 表現量，進而改變 OPC 的免疫狀態（圖四，右）。在小鼠控制組及健康人類微膠細胞、OLG 原先並未表現 SNP rs7191700 （圖四，左上），其上游的啟動子 Socs1 也未與染色質開放性提升的區域重疊。在加入 IFN-γ 後，啟動子 Socs1 的染色質開放性增加（圖四，中），並藉此提升 SNP rs7191700 附近的基因表現量。根據以上的結果，推論 MS 易感性 SNPs 可藉由 IFN-γ 等多種轉錄調控機制，影響 OPC 免疫基因的表現，而此表觀遺傳記憶的延續，最終導致成熟 OLG 維持在 MS 敏感的免疫狀態。

表觀遺傳學及多體學研究協助解釋疾病成因

研究團隊發現，多種多發性硬化症易感性 SNPs 及附近的基因受到染色體結構變化而啟動，揭開寡突膠細胞及其前驅細胞成為免疫系統攻擊目標的原因。此外，作者指出，此種寡突膠細胞的免疫調節機制，可能也存在於阿茲海默症、老化。總結來說，GWAS 幫助篩選可能的致病基因，表觀遺傳學、單細胞分析技術及多體學研究，則幫助研究者更深入瞭解基因調控機制，有助於未來免疫療法的發展，為多發性硬化症及更多退化性神經疾病的患者找到根除病痛的解方。

[註解一] 染色體是由組蛋白與 DNA 纏繞而成，在組蛋白上的化學修飾，如甲基化（methylation, me）及乙醯化（acetylation, ac），會改變染色體的結構，進而影響基因的表現量。如，組蛋白次單元 H3 上，第 4 個離胺酸甲基化（H3K4me3），可以促進核小體（nucleosome）重塑及組蛋白的乙醯化，使染色體解構變得鬆散，有利於基因轉錄。相反的，組蛋白次單元 H3 上的第 27 個離胺酸甲基化（H3K27me3）卻會造成染色體纏繞更加緊密，而不利於基因表現。因此 H3K4me3 與 H3K27me3 分別代表基因表現受到活化及抑制。此外，由於組蛋白的乙醯化和甲基化具有相反的功效，因此 H3K27 乙醯化（H3K27ac）也是基因活躍表現的標記 [4]。

[註解二] CTCF 是一種對於 DNA 序列具有專一性結合的轉錄因子，在哺乳動物中廣泛存在。 CTCF 可利用鋅手指（zinc-finger）的蛋白質構型，與染色體結合後，改變其結構，藉此調控基因的表現 [5]。

Main Article:

Meijer, M., Agirre, E., Kabbe, M., van Tuijn, C. A., Heskol, A., Zheng, C., … & Castelo-Branco, G. (2022). Epigenomic priming of immune genes implicates oligodendroglia in multiple sclerosis susceptibility. Neuron, 110(7), 1193-1210. https://doi.org/10.1016/j.neuron.2021.12.034

參考文獻：

[1] Uffelmann, E., Huang, Q. Q., Munung, N. S., De Vries, J., Okada, Y., Martin, A. R., … & Posthuma, D. (2021). Genome-wide association studies. Nature Reviews Methods Primers , 1 (1), 1-21.
[2] McGinley, M. P., Goldschmidt, C. H., & Rae-Grant, A. D. (2021). Diagnosis and treatment of multiple sclerosis: a review. JAMA, 325(8), 765-779.
[3] Chen, X., Litzenburger, U. M., Wei, Y., Schep, A. N., LaGory, E. L., Choudhry, H., … & Chang, H. Y. (2018). Joint single-cell DNA accessibility and protein epitope profiling reveals environmental regulation of epigenomic heterogeneity. Nature communications, 9(1), 1-12.
[4] Bernstein, B. E., Mikkelsen, T. S., Xie, X., Kamal, M., Huebert, D. J., Cuff, J., … & Lander, E. S. (2006). A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells. Cell, 125(2), 315-326.
[5] Lee, B. K., & Iyer, V. R. (2012). Genome-wide studies of CCCTC-binding factor (CTCF) and cohesin provide insight into chromatin structure and regulation. Journal of Biological Chemistry, 287(37), 30906-30913.

關鍵字：多發性硬化症、scRNAseq、scATACseq

撰文｜高佳煜
審稿｜王振宇、陳品萱、黃云宣