全球在新型冠狀病毒疫情肆虐下，mRNA疫苗的問世得以幫助我們的生活慢慢回歸到正軌，然而mRNA疫苗成功地開發除了要歸功於數十年在基因藥物上的研究外；能將mRNA順利送入體內的脂質運輸系統也是功不可沒，就讓我們來一探脂質運輸系統在基因藥物傳遞上重要的貢獻吧！
微脂體藥物運輸系統 (liposomal drug delivery system) 的發展有助於基因治療的推進，微脂體是具有雙層脂質構造的脂質奈米粒子 (lipid nanoparticles , LNP)，有良好的生物相容性，也因和細胞膜構造相似可自發性被胞吞進去[1]。另一種常見的藥物運輸系統是巨型單層脂質體 (large unilamellar vesicles, LUVs)，特點在於其尺寸約為 100 奈米，擁有單個雙層結構可將內部水相基質和外部環境隔開。利用腫瘤組織對奈米藥物特有的增強滲透滯留效應 (enhanced permeability and retention effect , EPR effect) [註一]，得以使 LUVs 作為載體的藥物有更長的作用時間，比起同樣劑量的原始藥物有更好的治療效果。
在設計 LNP 運輸藥物時需滿足幾個的條件，含要小於 100 奈米、必須能有效率地將藥物封裝進載體、可工業化量產及具有良好穩定度；更重要的是須保持電中性的外表層，以避免吸附過多血清蛋白，造成快速堆積而不易進入目標組織。
基因治療在發展上遇到的難題是未經修飾的核酸藥物並不穩定，核酸在生物體內運輸時容易被降解；且這些核酸也無從辨識目標細胞，更無法被目標細胞吸收。利用已經在小分子藥物上發展成熟的 LNP 系統協助運送基因藥物，卻受限於核酸本身尺寸較大，且帶負電荷而難以封裝進入 LNP。雖然利用帶有正電荷的陽離子脂質可以容易地和核酸聚合，但製造出來的 LNP 表面帶有正電荷，可能導致免疫反應被誘發。
後來進一步開發出可離子化的陽離子脂質 (ionizable cationic lipids) ，這些可離子化陽離子脂質上帶有解離常數 (pKa) 約 6.5 的胺基[2]，在酸性環境下帶有正電荷。因此透過在酸性 (pH = 4) 水相中快速溶於乙醇中的脂質和 RNA ，能更有效率地將 RNA 封裝至 LNP 中(圖一)。而這些 LNP 結構在生理條件下又可以恢復到電中性的狀態，便能解決因表面電荷造成的細胞毒性問題。
圖一、利用乙醇將藥物封裝進脂質奈米粒子的過程。靜電力驅使核苷酸主要被陽離子脂質包圍，形成含有核苷酸的反向胞 (inverted micelle)。如果混合過程夠快，使這些反向微胞沒有時間聚集，進而使 PEG-脂質在外層包圍反向微胞。圖片來源: https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2017.03.013
另外，LNP 顆粒的大小可以藉由加入聚乙二醇 (polyethylene glycol, PEG) 來調節[3]，增加越多的 PEG-lipid 能使 LNP 尺寸更小，不過因為減少了吸附 E 型載脂蛋白質 ( apolipoprotein E , ApoE ) 的能力，表面的 PEG 基團會抑制 LNP 作用於目標細胞，，為了改善這個問題，在 PEG 末端多修飾上短鏈醯基 (short C14 acyl chains)，可使 PEG-lipid 在體內的半衰期縮短以增加 LNP 的效力。
藉由調整脂質上胺基的 pKa 能進一步優化可離子化的陽離子脂質，使 LNP 在胞內體 (endosome) 較酸的環境中以質子化 (protonate) 的形式存在，因此 LNP 帶有正電荷，當陽離子脂質和胞內體內源性的陰離子脂質混合會形成錐狀構型(圖二)，便會破壞胞內體原本的雙層膜構造，成功釋放出藥物(圖三)。
圖二、陽離子脂質破壞雙層膜之機制。圖片來源: https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2017.03.013
圖三、利用脂質奈米粒子釋放 RNA, DNA 等基因藥物之機制。圖片來源: https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2017.03.013
Patisiran (Onpattro) 是用於治療多發性神經病變的核糖核酸干擾藥物 (siRNA) ，也是美國 FDA 第一個通過核准的核糖核酸干擾藥物， 2018 進入臨床三期試驗用患有遺傳性澱粉樣多發性神經病變 (hereditary transthyretin amyloidosis, hATTR) 的患者上有不錯的療效。 Patisiran 便是利用 LNP 將 siRNA 送入肝臟細胞，藉由 LNP 系統吸附上 ApoE ， ApoE 能與肝細胞上的低密度脂蛋白受體 (LDL receptor) 結合，進而將 siRNA 送入肝臟細胞(圖四)。
圖四、脂質奈米粒子傳遞 siRNA 藥至肝臟細胞之過程。PEG 質從米粒子表面的解離後，內源性的 ApoE 吸附至 LNP 表面，並與肝細胞上的低密度脂蛋白受體結合，進行胞吞作用。由於胞內體中的低 pH 值導致可電離脂質的質子化，帶正電的可電離脂質與帶負電荷的內源性脂質混合，導致胞內體膜的破壞，並將 siRNA 釋放到細胞質中。圖片來源: https://doi.org/10.1038/s41565-019-0591-y
經過許多科學家的努力，基因治療逐漸發展成熟。除了 COVID-19 疫苗外，利用 LNP 系統封裝的基因藥物也能夠被大量製造；臨床上，LNP 系統對於以肝臟細胞作為標的藥物已有不錯的治療效果，未來科學家更進一步投入以 LNP 系統作為基因藥物載體的研究上，致力於能更專一性地將基因藥物運送到定細胞。
註1:增強滲透滯留效應 (enhanced permeability and retention effect, EPR effect)
腫瘤組織因快速增生需大量養分及氧氣而使得腫瘤的內皮細胞間隙較大，可使大分子容易在腫瘤細胞內富集，且因腫瘤組織缺乏淋巴回流系統，造成大分子能長期滯留在腫瘤組織中。
Main Article:
(1) Cullis, P. R., & Hope, M. J. (2017). Lipid nanoparticle systems for enabling gene therapies. Molecular Therapy, 25(7), 1467-1475. https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2017.03.013
(2) Akinc, A., Maier, M.A., Manoharan, M. et al. The Onpattro story and the clinical translation of nanomedicines containing nucleic acid-based drugs. Nat. Nanotechnol. 14, 1084–1087 (2019). https://doi.org/10.1038/s41565-019-0591-y
參考文獻：
1. Cullis, P.R., Mayer, L.D., Bally, M.B., Madden, T.D., and Hope, M.J. (1989). Generating and loading of liposomal systems for drug-delivery applications. Adv.Drug Deliv. Rev. 3, 267–282.
2. Semple, S. C. et al. Efficient encapsulation of antisense oligonucleotides in lipid vesicles using ionizable aminolipids: formation of novel small multilamellar vesicle structures. Biochim. Biophys. Acta Biomembr. 1510, 152–166 (2001).
3. Belliveau, N. M. et al. Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA. Mol. Ther. Nucleic Acids 1, e37 (2012).
撰文：Investigator 團隊
審稿：洪維謙
