胸線是 T 細胞在分化成熟的過程中檢驗其分辨「自體」與「非自體」功能的關鍵篩選站：在這裡無法辨識敵我的 T 細胞會走向凋亡。只有通過篩選的 T 細胞才能進入循環系統 [1]。九成以上的 T 細胞將會死亡，並需要由擅長吞噬的胸腺巨噬細胞（thymic-resident macrophage）清除。常駐在胸腺中的巨噬細胞僅占胸腺細胞數量的 0.1%，據估計每顆胸腺巨噬細胞一天要吞噬約 50 顆凋亡的細胞。如此龐大的工作量伴隨著氧氣低下的環境，令人好奇這些賣力工作的巨噬細胞們是否具備獨特的機制來應對這些挑戰，也吸引來自陽明交大微免所的徐嘉琳老師團隊投入研究 [2]。
作為細胞的共通機制，新陳代謝是細胞獲取能量與材料的方式。新陳代謝使細胞得以維持生命並執行各種功能。新陳代謝中的各種代謝產物也成為表觀遺傳、轉譯後修飾與訊息傳遞中的關鍵角色。近年，科學家發現免疫細胞依賴不同的新陳代謝以支持不同的功能與適應不同的環境。因此，研究團隊從免疫代謝學（immunometabolism）的角度切入，希望了解胸腺巨噬細胞吞噬大量凋亡細胞的運作原理。
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為了解開這個謎題，團隊首先使用超高效液相層析-質譜儀（ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry, UPLC-MS）與 RNA 定序（RNA sequencing）分析小鼠胸腺巨噬細胞與腹腔巨噬細胞（peritoneal macrophage）的轉錄體（transcriptomic）與代謝體（metabolomic）間的差異。他們發現胸腺巨噬細胞有較多的精胺酸（arginine）與鳥胺酸（ornithine）代謝以及五碳醣磷酸路徑（pentose phosphate pathway, PPP）與其他代謝路徑。綜合分析的結果發現，胸腺巨噬細胞相比腹腔巨噬細胞有較活躍的脂質、胺基酸、核苷酸代謝以及五碳醣磷酸路徑，這些分析都指向共同的反應路徑：五碳醣磷酸路徑（圖一）。
圖一、五碳醣磷酸路徑示意圖，五碳醣磷酸路徑在抗氧化機制中扮演重要的角色，透過將葡萄糖氧化，產生 NADPH，用以還原重要的抗氧化物質穀胱甘肽（glutathione, GSH）。 圖片來源：https://doi.org/10.3389/fendo.2020.00365
五碳醣磷酸路徑是細胞分解葡萄糖的一個分支，該路徑產生細胞中大部分的 NADPH，而 NADPH 在細胞處理氧化壓力中扮演重要的角色。研究團隊假設胸腺巨噬細胞增加使用五碳醣磷酸路徑可能源自氧化壓力的提升。為了探討五碳醣磷酸路徑與氧化壓力的關聯，團隊進一步比較小鼠胸腺巨噬細胞與腹腔巨噬細胞，發現胸腺巨噬細胞確實有豐富的活性含氧物（reactive oxygen species, ROS）和以 NRF2 為首的多個氧化壓力指標，表示胸腺巨噬細胞確實處於氧化壓力中。氧化壓力可能受到環境或特殊的代謝需求影響，為了釐清氧化壓力的來源，團隊使用單細胞 RNA 定序（single-cell RNA-seq）分析胸腺中不同免疫細胞的基因表現，發現胸腺巨噬細胞有著較高的 Hif1a、G6pdx（五碳醣磷酸路徑的速率決定酵素）、Mertk（協助吞噬凋亡細胞的受體）表現量（圖二）。這些跡象顯示氧化壓力特有於胸腺巨噬細胞中，而其他的胸腺免疫細胞並沒有相同現象，因此胸腺巨噬細胞的氧化壓力不是源於共同環境，並可能與其細胞功能有所連結。
圖二、經由單細胞 RNA 定序分析，可得知胸腺中不同細胞的基因表現差異，其中胸腺巨噬細胞有著較高的 Hif1a、G6pdx 及 Mertk 表現量。 圖片來源：https://doi.org/10.1016/j.celrep.2022.111065
為了驗證假設，團隊透過刺激骨髓造血幹細胞成為巨噬細胞（bone marrow-derived macrophage），並於低氧環境中給予凋亡細胞作為刺激以模擬胸腺環境。結果觀察到細胞內的活性含氧物顯著增加、GSH/GSSG 的比值降低、 NADP/NADPH 的比值則上升。作為細胞對氧化壓力的反應指標，HIF-1α、NRF2 及 G6pdx 的表現量也上升（圖三）。正如在小鼠胸腺巨噬細胞中觀察到的：胸腺巨噬細胞吞噬了凋亡細胞後會導致氧化壓力，並需要五碳醣磷酸路徑的支援。在後續實驗中，團隊使用同位素標記的葡萄糖追蹤細胞對糖的利用，比較未刺激巨噬細胞與模擬胸腺環境中巨噬細胞的代謝動態。實驗顯示在胸腺環境下，為了應對吞噬凋亡細胞帶來的氧化壓力，巨噬細胞會使更多的葡萄糖進到五碳醣磷酸路徑中。
圖三、（A）模擬胸腺環境下的巨噬細胞示意圖。（B、C）添加凋亡胸腺細胞後，巨噬細胞的活性含氧物增加、HIF-1α 表現也增加。 圖片來源：https://doi.org/10.1016/j.celrep.2022.111065
在瞭解巨噬細胞透過五碳醣磷酸路徑調節吞噬凋亡細胞的氧化壓力後，為了進一步展示該路徑的重要性，團隊分別使用小分子抑制劑 6-AN（6-aminonicotinamide）與短小干擾 RNA（small interfering RNA, siRNA）抑制 G6PD 的作用，觀察到巨噬細胞內的活性含氧物增加且吞噬能力降低，並且這些現象可藉由補充 GSH-MEE（細胞膜可通透之 GSH）或乙酰半胱胺酸（N-acetylcysteine, NAC, 合成 GSH 的材料）來緩解。在活體小鼠實驗中，若將 G6PD 抑制劑打入胸腺中，胸腺中的凋亡細胞將會堆積，顯示若抑制五碳醣磷酸路徑將會使胸腺中的凋亡細胞無法被有效清除。
綜合以上結果，本篇研究發現五碳醣磷酸路徑在調節吞噬作用導致的氧化壓力具有不可忽視的作用，並描繪出路徑中的關鍵酵素 G6PD 缺乏將阻礙巨噬細胞清除凋亡細胞的能力。巨噬細胞吞噬凋亡細胞的現象不僅能在胸腺中發現，在傷口及腫瘤中也非常重要。對於了解凋亡細胞清除的機制，本篇研究提供了綜觀的新陳代謝視野，也針對巨噬細胞使用五碳醣磷酸路徑做出進一步的研究。
圖片來源：https://doi.org/10.1016/j.celrep.2022.111065
參考文獻：
1. Takaba, H., & Takayanagi, H. (2017). The Mechanisms of T Cell Selection in the Thymus. Trends in immunology, 38(11), 805–816. https://doi.org/10.1016/j.it.2017.07.010
2. Tsai, T. L., Zhou, T. A., Hsieh, Y. T., Wang, J. C., Cheng, H. K., Huang, C. H., Tsai, P. Y., Fan, H. H., Feng, H. K., Huang, Y. C., Lin, C. C., Lin, C. H., Lin, C. Y., Dzhagalov, I. L., & Hsu, C. L. (2022). Multiomics reveal the central role of pentose phosphate pathway in resident thymic macrophages to cope with efferocytosis-associated stress. Cell reports, 40(2), 111065. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2022.111065
撰文｜葉國掄
審稿｜蔡宗霖
