癌症為全球第二大死因。即使現在有許多先進的醫療技術，許多癌症病患在被診斷後，其身上的癌細胞就可能已經有抗性，使得許多療法都顯得效力不彰。近年來，免疫療法已經被視為攻克癌症的新趨勢。其方法為透過強化患者自身的免疫系統去打擊癌症，相對於傳統化療有更高的專一性及更低的副作用。臨床上雖然已經證實免疫療法可有效抑制癌症持續發展，但也有不少患者對免疫療法沒有明顯的反應，尤其實體腫瘤（solid tumor），其關鍵原因為複雜的腫瘤微環境（tumor microenvironment, TME）。實體腫瘤除了癌細胞外，還有免疫細胞、纖維母細胞和其他有助於形成細胞外基質（extracellular matrix, ECM）的細胞等等。這些細胞可以釋放各種信號分子抑制免疫（immunosuppression）反應，促使腫瘤的生長。此外，如此複雜的微環境也成為了投遞抗癌藥到腫瘤核心時的重重阻礙。
肝細胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是一種主要發生在肝臟的惡性腫瘤。HCC 的生成已知與發炎性腫瘤微環境 （inflammatory TME）息息相關，導致免疫細胞抗腫瘤的反應被抑制及產生異常。HCC 特殊的腫瘤微環境更是讓免疫療法的成效大打折扣 [1]。因此，發展新的治療策略是當前所需，以克服腫瘤微環境對免疫療法的抑制。
為了克服當前基因傳遞載體至腫瘤微環境所面臨的挑戰，台灣清華大學陳韻晶團隊設計了一種具有複合功能的脂質奈米粒子（nanoparticles, NPs）（圖一），其特性包含：（一）表面具有對肝細胞癌有專一性的標靶肽（SP94），可增強 NPs 在肝細胞癌中的累積，促使治療用的質體 DNA （pDNA）【註解一】 及短小干擾 RNA （siRNA）【註解二】更有效率地傳遞至肝細胞癌中；（二）核心中有受酸鹼值調控的的磷酸鈣（CaP），可使奈米粒子達到核內體逃脫（endosomal escape），以增強核酸 pDNA/siRNA 在癌細胞內的釋放；（三）除了 CaP ，奈米粒子核心中另有胸腺嘧啶端基的聚酰胺胺（PAMAM）樹枝狀聚合物 （dendrimer），進一步增強核內體逃脫和協助 pDNA 進到細胞核內，以達到基因轉染（transfection）的目標；以及（四）樹枝狀聚合物同時可以激活干擾素刺激因子（stimulator of interferon genes, STING）－腺苷酸合成酶（cGAS）途徑，輔助免疫療法，並提升細胞的免疫反應。透過以上特性，該研究利用癌細胞株及小鼠實驗來驗證其可能的抗癌功效。
【註解一】此篇研究利用 pDNA 促進細胞因子（cytokines）Interleukin 2（IL-2）在細胞中的表現及釋放。IL-2 對於免疫調節作用扮演重要的角色，並在臨床上用於促進 T 細胞增殖及活化其功能。其中，CD8 T 細胞更是在對抗癌的首要免疫細胞之一。
【註解二】此篇研究利用 siRNA 抑制 programmed death-ligand 1（PD-L1）在癌細胞中的表現。癌細胞可以透過表現 PD-L1 與 T 細胞上的的蛋白 programmed cell death protein 1（PD-1）結合，進而逃過免疫 T 細胞的攻擊力。因此，透過抑制癌細胞上的 PD-L1 表現可以讓 T 細胞重新辨認且攻擊癌細胞，導致癌細胞死亡。
圖一、此研究中奈米粒子（TT-LDCP NPs）之設計及其在老鼠體內抗癌機制之示意圖：奈米粒子表面嵌上辨認肝細胞癌的標靶肽（SP94），其奈米粒子核中包覆著抑制免疫檢查點 PD-L1 的 siRNA 和編碼免疫刺激細胞因子 IL-2 的 pDNA。由於樹枝狀聚合物/CaP 複合物可增強 pDNA 傳送到細胞核內，此方式可大大提升基因轉染的效率。此外，樹枝狀聚合物還能刺激 STING 途徑，進一步使腫瘤微環境中的樹突細胞（dendritic cell, DC）成熟，並與 CD8 T 細胞交互作用，使其活化達到毒殺癌細胞的能力。透過奈米粒子有效地投遞 PD-L1 siRNA 和 IL-2 pDNA，可以提高 IL-2 的腫瘤特異性表現及抑制癌細胞表面 PD-L1 表現。此共同基因調控方式可以增加肝細胞腫瘤中 CD8 T 細胞的浸潤和活化，以達到顯著抗腫瘤的功效。 圖片來源：http://doi.org/10.1126/sciadv.aax5032
在細胞實驗中，相比於不具標靶性的 NPs，載入在 TT-LDCP NPs 中的 IL-2 pDNA 能促使細胞分泌更多的 IL-2（圖二 A），並且能最有效地抑制細胞中的 PD-L1 表現量（圖二 B）。接著，作者利用小鼠評估載有 PD-L1 siRNA 和 IL-2 pDNA 的 TT-LDCP NPs 對於原位移植的肝細胞癌中 PD-L1 和 IL-2 的影響。結果顯示，注射裝載 PD-L1 siRNA 和 IL-2 pDNA 的 TT-LDCP NPs 入小鼠體內後，相較於其他控制組， TT-LDCP 組可以顯著降低肝腫瘤中的 PD-L1 及增加了 IL-2 表現（圖二 C 及 D）。另外，載有 PD-L1 siRNA 和 IL-2 pDNA 的 TT-LDCP NPs 促使更多 CD8 T 細胞浸潤於小鼠肝細胞癌中（圖二 E），但不影響 CD4 T 細胞浸潤的數量（圖二 F）。意味著此方法能有效促進抗腫瘤的免疫 CD8 T 細胞的反應。接著，作者也觀察到注射載有 PD-L1 siRNA 和 IL-2 pDNA 的 TT-LDCP NPs 除了可抑制小鼠體內原發腫瘤的生長（圖二 G），還能抑制遠端的肺部轉移（圖二 H 及 I）。
圖二、肝癌細胞株 HCA-1 在不同 NPs 處理下用（A）酵素連結免疫吸附分析法（Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）分析 IL-2 表現量及（B）西方墨點法檢測 PD-L1 在細胞中的表現量。在小鼠原位肝癌細胞移植實驗中，比較不同的 NPs 如何改變腫瘤中的（C 及 D） IL-2 和 PD-L1 的表現量；（E） CD8 T 細胞和（F）CD4 T 細胞浸潤數量；（G）原位腫瘤生長及進一步的（H 及 I）肺轉移。 圖片來源：http://doi.org/10.1126/sciadv.aax5032
腫瘤微環境中抑制免疫反應的特性，也是造成癌症疫苗免疫療法失敗的主因。因此，作者接著檢視載有 PD-L1 siRNA 和 IL-2 pDNA 的 TT-LDCP NPs 能否在小鼠體內恢復癌症疫苗的效力。結果顯示，相較其他組別，在共同注射癌細胞疫苗及載有 PD-L1 siRNA 和 IL-2 pDNA 的 TT-LDCP NPs 後（圖三 A），有更多 CD8 T 細胞浸潤於小鼠肝細胞腫瘤中（圖三 B、C 及 D）。此外，合併使用癌細胞疫苗及載有 PD-L1 siRNA 和 IL-2 pDNA 的 TT-LDCP NPs 可大幅抑制原發腫瘤的生長及遠端肺轉移（圖三 F），同時提高小鼠的存活率（圖三 G）。
圖三、（A）注射癌細胞疫苗及載有 PD-L1 siRNA 和 IL-2 pDNA 的 TT-LDCP NPs 的動物實驗示意圖。量測癌細胞疫苗及免疫基因療法後腫瘤中（B） CD8 T 細胞數量；（C 及 D）顆粒酶 B 陽性的 CD8 T 細胞數量；（E）干擾素-γ 陽性的 CD8 T 細胞數量；（F）生長及肺轉移之情形及（G）小鼠存活率。 圖片來源：http://doi.org/10.1126/sciadv.aax5032
最後，作者嘗試驗證載有 PD-L1 siRNA 和 IL-2 pDNA 的 TT-LDCP NPs 是否有其他訊息傳遞途徑可以活化 CD8 T 細胞，例如先前研究曾指出有些 NPs 可以透過調控 STING 途徑促進樹突細胞的成熟，進一步與 CD8 T 細胞交互作用 [2]。細胞實驗結果顯示，該特殊 NPs 可以活化 STING 途徑中的下游相關因子 TBK1 及 IRF3（圖四 A），而且可以誘發 STING 途徑引起的發炎因子如 CCL5、CXCL10 及 IFN-β（圖四 B）。小鼠實驗也證實，注射載有 PD-L1 siRNA 和 IL-2 pDNA 的 TT-LDCP NPs 後，肝細胞瘤中有更多成熟的樹突細胞（圖四 C）。
圖四、載有 PD-L1 siRNA 和 IL-2 pDNA 的 TT-LDCP NPs 能促使（A） STING 下游因子 TBK1 及 IRF3 被磷酸化；（B）增加發炎因子如 CCL5、CXCL10 及 IFN-β 的表現及（C）促進肝腫瘤內的樹突細胞成熟。 圖片來源：http://doi.org/10.1126/sciadv.aax5032
結論，該團隊證明了透過新穎的奈米技術可以高效的，且具有選擇性地標靶腫瘤微環境。透過包覆兩種核酸：(一) siRNA 干擾癌細胞的免疫抑制功能及 (二) pDNA 製造的細胞激素刺激免疫反應，來大大提升抗癌症的效果。並且與癌症疫苗共同使用，未來有可能作為臨床上新的雞尾酒免疫療法。
Main article:
Huang, K. W., Hsu, F. F., Qiu, J. T., Chern, G. J., Lee, Y. A., Chang, C. C., … & Chen, Y. (2020). Highly efficient and tumor-selective nanoparticles for dual-targeted immunogene therapy against cancer. Science advances, 6(3), eaax5032.
參考文獻：
- Chen, Y., Ramjiawan, R. R., Reiberger, T., Ng, M. R., Hato, T., Huang, Y., … & Duda, D. G. (2015). CXCR4 inhibition in tumor microenvironment facilitates anti‐programmed death receptor‐1 immunotherapy in sorafenib‐treated hepatocellular carcinoma in mice. Hepatology, 61(5), 1591-1602.
- Laoui, D., Keirsse, J., Morias, Y., Van Overmeire, E., Geeraerts, X., Elkrim, Y., … & Van Ginderachter, J. A. (2016). The tumour microenvironment harbours ontogenically distinct dendritic cell populations with opposing effects on tumour immunity. Nature communications, 7(1), 13720.
撰文 | 張櫂杬
審稿 | 葉國掄
