細胞治療的彈藥庫：臨床級 iPS 細胞庫的建置 (上)－HLA 同型合子 iPSCs

細胞治療為近年新興療法中廣受重視的一環，對於不同的組織器官、疾病的療法研究與臨床應用開發都在世界各地如火如荼的進行，陸續有許多相應的臨床試驗結果，國內外也有部分產品製劑、療法被核可投入臨床治療 [1, 2]。然而目前許多療法仍受限於成本、技術等因素，難以廣泛性的讓更多病患所使用。為了要使細胞治療推行得更加順利，相當於細胞治療彈藥庫角色的臨床級細胞資源庫就顯得格外重要。

得益於多樣的分化能力，幹細胞在細胞治療的領域中便扮演舉足輕重的角色。其中，由日本京都大學山中伸彌教授團隊於 2006 年開發的誘導型多潛能幹細胞 (induced pluripotent stem cells, iPSCs) 技術 [3, 4]，除了成功避免了使用胚胎幹細胞的倫理爭議，也證明了成體細胞能夠藉由重新編程 (reprogramming) 回到多潛能分化能力 (pluripotency) 的幹細胞狀態，可以分化為體內各種類型的細胞，進一步應用於體外疾病模型建立、藥物開發和再生醫學等面向，也因此備受關注。山中伸彌教授也因著此項技術的開發共同獲得了 2012 年諾貝爾生理醫學獎的殊榮。日本也因此投入大量資源在 iPS 細胞的研究開發，在京都大學成立 iPS 細胞研究所 (Center for iPS Cell Research and Application, CiRA) 與基金會 (CiRA-F)，推進相關技術的發展。為了使 iPS 細胞技術能夠有更廣泛的應用，京都大學 iPS 研究所也開展了臨床級 iPS 細胞庫 (iPS Cell Stock Project) 的計畫 [5]，期望能作為日本乃至世界 iPS 臨床細胞資源的基礎與靠山。

 

HLA 同型合子 iPS 細胞庫 (iPS Cell Stock Project: HLA-homozygous iPS cells)

雖然自體來源 (autologous) 的細胞，在細胞移植治療上較可以避免掉免疫排斥的問題，然而目前相關的技術難度與成本問題仍待克服。因此異體的細胞做為另一種細胞來源的途徑也被納入考量。經過研究估計，日本人口的人類白血球抗原 HLA (human leukocyte antigen) 的單倍體基因型 (haplotype) 多樣性並不高，10 名 HLA 同型合子的捐贈者 (HLA-homozygous donors) 便可以覆蓋對應日本 50% 的人口，140 名捐贈者則可以對應 90% 的日本人口 [6]。

因此自 2013 年起，京都大學 iPS 研究所與日本紅十字會、骨髓與臍帶血相關組織合作，招募 HLA 同型合子的捐贈者 (HLA-homozygous donors)，依照 HLA 基因型對應人口的比例多寡，依序以捐贈者血液樣本作為來源製作成 iPS 細胞，用以建立臨床級的 iPS 細胞半吻合資源庫 (haplobank) [7]。並於 2015 年開始率先推出從 7 位捐贈者細胞來源所建立的 27 個臨床級 iPS 細胞株，這些細胞株對應 4 種日本人口中最常見的 HLA 單倍體基因型，可以覆蓋大約日本 40% 的人口 [8]。

為了要建立如此大規模的臨床級細胞庫，其中有許多繁瑣而嚴謹的步驟，用來確認建立的 iPS 細胞株的有效性、安全性和品質。從招募捐贈者和獲取來源樣本開始，關於捐贈者的健康狀態、個人隱私、倫理等面向都需要經過評估和審核。捐贈者提供的樣本也會進行血型測試、HLA 類型確認、肝炎抗體測試、多種不同的病毒序列測試，用以篩選出適合使用的樣本。

通過嚴格篩選後的人體血液樣本，將進一步用於後續的 iPS 細胞製作。首先挑選出有表現 CD34 的細胞進行擴增培養，之後利用電穿孔 (electroporation) 的方式送入包含不同因子 (Oct3/4, Sox2, Klf4, L-Myc, Lin28, mp53DD, EBNA1) 的五種質體載體，進行細胞重編程的處理，重編程的效率大約為 0.01% 到 0.06% 之間。為了增進製作效率與降低細胞繼代的次數，後續的處理方式也根據處理的經驗進行了調整，演進出了三種方法。雖然操作方式有所不同，但三種方法都會經過無菌檢驗、黴漿菌檢驗等多個步驟的測試和篩選。操作過程中也可區分出初級細胞庫 (primary cell stock, PCS) 和二級細胞庫 (secondary cell stock, SCS) 兩種階段，會進行額外的擴增培養和凍存。第一、二種方法在建立初級細胞庫之前都會先進行細胞群體 (cell colony) 的挑選，兩者差異在於第二種方法多加入了限數稀釋法 (limiting dilution process) 的步驟用以去除少量殘留的重編程載體，也將細胞打散為單一細胞在培養盤上各別進行培養。第三種方法則進一步省去了第二種方法中細胞群體的篩選步驟，整體而言可以讓細胞繼代數從 p9、p10 降為 p7。所有操作過程也都會遵循著 GMP 優良製造規範的指引進行。

除了上述操作方法的各項規範，產出的 iPS 細胞株也都會進行多種 QC 品質管制的檢測。測試項目包含了細胞型態、重編程載體的殘留、染色體核型分析 (karyotyping)、全外顯子定序 (whole exome sequencing, WES)、全基因體定序 (whole genome sequencing, WGS)、單核苷酸多型性陣列 (SNP array) 等方法，用以偵測單核苷酸變異 (single nucleotide variants, SNVs)、序列的插入與刪除 (insertion/deletions, indels) 和拷貝數變異 (copy-number variation, CNV)。除此之外，關於常見的生物標識也會進行測定，例如可表示未分化狀態的 TRA-1-60 和 SSEA-4。而除了這些 QC 檢測之外，在存入細胞庫前也會再進行微生物無菌檢驗、黴漿菌檢驗、內毒素檢驗、病毒檢驗、型態檢查等測試。

為了確定建立的 iPS 細胞株確實具有相應的幹細胞多能性 (pluripotency)，這些細胞也進行了三胚層分化能力的測試，用以確保具有相似於胚胎幹細胞的分化潛能。此外，這些建立的 iPS 細胞株也被拿來與其他過往已廣泛用於研究的 iPS 細胞株進行比較，確定培養的細胞群體和胚胎幹細胞的型態相近，且基因表現和以往的細胞株相似。從測試的 PCA 主成分分析結果中也發現，不同捐贈者來源的細胞呈現出了捐贈者相關的異質性，其中也與不同捐贈者的性別差異有關。這也顯示出了 iPS 細胞的異質性，甚至即便來自相同捐贈者的不同株細胞，也可能具有不同的分化能力傾向 (differentiation propensity)。這些不同的分化能力傾向也和後續臨床應用息息相關，在應用於不同細胞類型的分化時便可以從中進行挑選，找出最合適的細胞株進行使用。也因此細胞庫的建立，是從 7 個捐贈者為來源，一對多的建立出了 27 株的 iPS細胞株，可以提供後續不同臨床應用的選擇。

近年台灣中研院的謝清河博士團隊也有進行相關的計畫，共招募 1000 名健康捐贈者，從中篩選出 13 名具有代表性的 HLA 同型合子的捐贈者建立 iPS 細胞，進一步分化為心肌和神經細胞，展現了這些 iPS 細胞在高通量化合物毒性篩選的應用。而這些 iPS 細胞經研究團隊估計可以對應到 16% 的台灣人口，以全世界來看甚至能覆蓋到 4.77 億的人口 [9]。

此項 HLA 同型合子的方法，提供了建立異體細胞來源 iPS 細胞庫的一種可行的策略。然而此項策略若是要推廣到覆蓋全日本人，甚至是全世界具有更多樣 HLA 類型組合的人口，便需要建立更多不同類型的細胞株。但要找到適合的 HLA 同型合子捐贈者其實也並不容易，是以其他不同的臨床細胞庫的建立策略也有其必要性。針對此項問題，京都大學 iPS 研究所的臨床級 iPS 細胞庫計畫，也在陸續的幾年後推出了不同的解方，將在下篇 【細胞治療的彈藥庫－臨床級 iPS 細胞庫的建置 (中)】繼續為大家進行介紹。

 

參考文獻：

1. Approved cellular and gene therapy products. (2022, June 23). U.S. Food and Drug Administration.
   https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/cellular-gene-therapy-products/approved-cellular-and-gene-therapy-products
2. 衛生福利部 細胞治療技術資訊專區 – 衛福部核准細胞治療技術
   https://celltherapy.mohw.gov.tw/tech_search.htm
3. Takahashi, K., & Yamanaka, S. (2006). Induction of Pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell, 126(4), 663-676. https://doi.org/10.1016/j.cell.2006.07.024
4. Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K., and Yamanaka, S. (2007). Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 131, 861–872. https://doi.org/10.1016/j.cell.2007.11.019
5. CiRA Foundation – iPS Cell Stock Project
   https://www.cira-foundation.or.jp/e/research-institution/ips-stock-project/
6. Okita, K., Matsumura, Y., Sato, Y., Okada, A., Morizane, A., Okamoto, S., Hong, H., Nakagawa, M., Tanabe, K., Tezuka, K., Shibata, T., Kunisada, T., Takahashi, M., Takahashi, J., Saji, H., & Yamanaka, S. (2011). A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods, 8(5), 409-412. https://doi.org/10.1038/nmeth.1591
7. iPS Cell Stock Project – HLA-homozygous iPS cells
   https://www.cira-foundation.or.jp/e/research-institution/ips-stock-project/homozygous.html
8. Yoshida, S., Kato, T. M., Sato, Y., Umekage, M., Ichisaka, T., Tsukahara, M., Takasu, N., & Yamanaka, S. (2023). A clinical-grade HLA haplobank of human induced pluripotent stem cells matching approximately 40% of the Japanese population. Med, 4(1), 51-66.e10. https://doi.org/10.1016/j.medj.2022.10.003
9. Huang, C. Y., Nicholson, M. W., Wang, J. Y., Ting, C. Y., Tsai, M. H., Cheng, Y. C., Liu, C. L., Chan, D. Z., Lee, Y. C., Hsu, C. C., Hsu, Y. H., Yang, C. F., Chang, C. M., Ruan, S. C., Lin, P. J., Lin, J. H., Chen, L. L., Hsieh, M. L., Cheng, Y. Y., … Hsieh, P. C. (2022). Population-based high-throughput toxicity screen of human ipsc-derived cardiomyocytes and neurons. Cell Reports, 39(1), 110643. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2022.110643

撰文｜藍冠鈞
審稿｜蕭皓文

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