細胞治療的彈藥庫：臨床級 iPS 細胞庫的建置 (中)－HLA 基因體編輯 iPSCs

在「細胞治療的彈藥庫－臨床級 iPS 細胞庫的建置 (上)」一文中，我們介紹了京都大學 iPS 研究所首先推行的第一種臨床 iPS 細胞庫的建置策略 ── HLA 同型合子 iPS 細胞庫 (iPS Cell Stock Project: HLA-homozygous iPS cells)。此一策略提供了異體來源細胞庫的一種可行方向，然而為了要進一步擴大可涵蓋的人口數以符合更多樣的需求，不同的執行策略也在後續幾年中陸續的推行而出。

HLA 基因體編輯 iPS 細胞 (iPS Cell Stock Project: HLA-genome-edited iPS cells)

雖然利用找尋 HLA 同型合子的方式可以建立覆蓋較多人口的細胞庫，但目前仍有 60% 的日本人口並未涵蓋在內。此外，實際上要找到適合的 HLA 同型合子的捐贈者並不容易；按照研究估計，如果要建立覆蓋 90% 日本人口的 140 種 HLA 同型合子細胞株，需要從超過 15 萬名捐贈者中去做篩選 [1]，甚至對於更多樣化的全球人口而言便還需要從更多的捐贈者中篩選，用以建立更多的細胞株。因此京都大學 iPS 研究所也著手推行了第二種策略，當中採用了 CRISPR-Cas9 基因體編輯技術，以建立 HLA 基因體編輯 iPS 細胞庫。此項策略可以針對特定 HLA 基因進行選擇性剔除，被稱為 HLA 遮蔽 (HLA cloaking) 技術 [2]，預期可以進一步降低免疫排斥的影響。

京都大學 iPS 研究所的團隊在 2019 年於 Cell Stem Cell 期刊發表的研究中提出了兩種作法，第一種方法是利用特定等位基因剔除 (allele-specific knockout)，將 HLA 異型合子的 iPS 細胞 (HLA heterozygous iPSCs) 轉變為 HLA 偽同型合子的 iPS 細胞 (HLA pseudo-homozygous iPSCs)，以達到類似於 HLA 同型合子 iPS 細胞的效果。也因為具有類似特性，這個方法被預期能夠輔助於建立 HLA 同型合子 iPS 細胞庫，但也同樣會面臨需要建立較多數量類型的細胞株，才能夠覆蓋較多人口比例的問題。

因此相應開展的第二種作法則是想要剔除 HLA 基因來降低免疫排斥。而過往的研究策略是藉由基因編輯剔除會與第一型 HLA 蛋白形成蛋白異二聚體 (heterodimer) 的 β2微球蛋白 (β2-microglobulin, B2M 基因)，使第一型 HLA 蛋白無法正常在細胞表面呈現，進而達到去除所有第一型 HLA 分子 (HLA-A, -B, -C, -E, -F, -G) 的目的，以避免胞毒型 CD8+  T 細胞的免疫反應。然而缺少了這些 HLA 分子反而會誘發自然殺手 (NK) 細胞的免疫反應，甚至還會因為失去 HLA 的抗原呈現功能，造成正常的 T 細胞對應病原體感染和癌化細胞的免疫功能無法作用，額外造成不必要的風險 [3]。

因此這項策略的設計便轉為利用基因編輯對第一型 HLA 的 HLA-A 和 HLA-B 進行雙等位基因剔除，但保留了單一單倍體基因型 (single haplotype) 的 HLA-C，以及其他非典型的 HLA (HLA-E、-F、-G)，讓 NK 細胞可以辨識而不會進行攻擊，此種策略所得出的細胞便被稱為 HLA-C 保留 iPS 細胞 (HLA-C-retained iPSCs)。在體外細胞培養與小鼠體內的研究測試結果中，可以發現此種 HLA-C 保留的 iPS 細胞，能夠同時避免 CD8+ T 細胞和 NK 細胞免疫毒性的作用，同時保留抗原呈現的能力 [3]。

而除了上述提及受到 CD8+ T 細胞辨識的第一型 HLA 之外，第二型的 HLA 分子也會受到 CD4+ 輔助型 T 細胞的辨識，並藉由細胞激素 (cytokine) 對其他免疫細胞進行調控。因此為了要讓 HLA-C 保留的 iPS 細胞 (HLA-C-retained iPSCs) 能有更好的免疫相容性，對第二型 HLA 分子 (HLA-DP, -DQ, -DR 等) 的基因編輯剔除也被納入考量。而過去的研究已知第二型 HLA 基因的轉錄必須有 CIITA (major histocompatibility complex [MHC] class II transactivator) 基因的參與，是以利用基因編輯剔除 CIITA 基因便可以達到去除第二型 HLA 的目的。而研究實驗結果也證明，配合 CIITA 基因編輯剔除第二型 HLA 的 HLA-C 保留 iPS 細胞，可以同時具有避免 CD8+ 胞毒型 T 細胞、CD4+ 輔助型 T 細胞和 NK 自然殺手細胞免疫反應的特性 [3]。

依據研究估計，如果要涵蓋 95% 的日本人口，第一種 HLA 偽同型合子的策略需要 73 種細胞株，而第二種 HLA 基因體編輯的 iPS 細胞株更是減少到只需要 7 種就能達成。而面對全世界更多元的人口組成，利用 HLA 基因體編輯的策略，也僅需要 12 株 iPS 細胞便可以覆蓋全世界超過 90% 的人口 [3]。對比於 HLA 同型合子細胞庫所需要超過百株的細胞數量，可看出這兩種策略的效益。

依據研究上的成果，2020 年開始京都大學 iPS 細胞研究基金會也正式投入進行臨床級的 HLA 基因組編輯 iPS 細胞庫的建置。因應後續實際在醫療上的應用，臨床級 iPS 細胞的建立也同樣嚴謹遵守著 GMP 優良製造規範的指引進行。操作上也是利用 CRISPR-Cas9 基因編輯技術，對 HLA 同型合子的 iPS 細胞進行 HLA-A、HLA-B 和CIITA 基因的剔除。而之所以選用 HLA 同型合子而非異型合子的 iPS 細胞進行基因編輯，也是為了簡化流程，可以使用單一種嚮導 RNA (guide RNA; gRNA) 同時對雙等位基因進行剔除，減少整體所需的嚮導 RNA 類型數量。此外，為了縮短建置細胞株的耗時與減少細胞的繼代次數，基因編輯的做法也從多次依序編輯，改為一次對三個目標同時進行三重基因剔除。操作耗時可以從 4.5 個月縮短到 1.5 個月，細胞繼代次數也從 18 次減為 6 次 (圖二) [4]。

如同前一篇所介紹的臨床 iPS 細胞庫的建置流程，各項經過基因編輯後的 iPS 細胞株也會經過一連串的安全性、品質、效能的多重篩選與確認。除了利用 RNA 定序與流式細胞分析技術 (flow cytometry, FCM) 確認有成功剔除目標的幾種 HLA 基因外，另外也利用染色體核型分析 (karyotyping)、桑格定序 (Sanger sequencing)、全基因體定序 (whole genome sequencing, WGS)、光學基因體測繪 (Optical Genome Mapping) 等方式檢測基因體是否異常，也和基因編輯前的 iPS 細胞進行比較，檢測在基因編輯與細胞群篩選分離培養過程中是否有出現基因突變。經過基因編輯的 iPS 細胞也和基因編輯前的 iPS 細胞進行了分化能力的測試比較，確定仍保有三胚層的分化能力，也測試特定細胞系 (如：心肌) 的分化，用以確保具有相似的分化能力 [4]。 

在 2022 年發表的研究成果中，研究團隊從 41 個經過 HLA 基因體編輯的 iPS 細胞殖株 (clone) 中進行各項的檢驗與篩選，最終僅有 3 個細胞殖株通過所有的篩選條件，成功率其實並不高，也遠低於研究團隊原先的預期 (圖三) [4]。其原因也可能和同時進行的三重基因剔除有關，基因編輯區位的非正常修復也可能會造成額外的基因突變。然而為了使流程簡化，且減少需重複送入外來基因對細胞的負擔，這樣對成功率的影響可能還是不可避免的。

而在建立了 iPS 細胞庫之後，陸續幾年 iPS 細胞研究基金會也提供了許多研究用與臨床用的 iPS 細胞到各個合作研究單位、企業，進一步分化成所需要的不同細胞類型，應用在各種疾病的療法開發 (圖四) [5]。上篇文章提及的臨床級 HLA 同型合子 iPS 細胞，也自 2021 年 5 月起成功發送到日本以外的國家進行臨床試驗的使用，這也表示相關的細胞製造流程已經可以被部分國家的相關法規審查機構所認可 [6]。

而就在上周 2023 年 6 月中開始，臨床級 HLA 基因體編輯的 iPS 細胞也終於釋出讓學研單位與企業申請使用 [7]。雖然這些建立的 HLA 基因體編輯 iPS 細胞已經通過嚴謹的篩選審核，但因為這仍是全新的策略與技術，在臨床上實際使用的效用與安全性，以及 HLA 的選擇性剔除對於降低免疫排斥的實際效果，還需要倚靠後續不同的臨床試驗來進一步的證明。

仙台病毒載體 iPS 細胞 (iPS Cell Stock Project: SeV-iPS cells)

除了上述成功往日本以外國家提供臨床級 iPS 細胞的案例，為了更進一步推進 iPS 細胞在國際上的應用，符合不同國家的相關臨床使用規範和使用者的需求；自 2023 年 4 月開始，京都大學 iPS 細胞研究基金會也另外推出了一種利用仙台病毒 (Sendai virus) 進行細胞重編程 (reprogramming) 的製備方法所建立的臨床級 iPS 細胞株，稱為 SeV-iPS 細胞 [8]。此種方法建立的細胞是使用仙台病毒載體替換先前使用的質體游離載體 (episomal vector)，用來將重編程因子送入細胞。此兩種載體雖然都屬於不會嵌入細胞基因體的類型，不會因此造成細胞毒性或是基因體的異常，不過 SeV-iPS 細胞被認為可能在某些細胞類型上有較好的分化效率，是以臨床使用上也提出了這樣的需求。而此次首先所對外釋出的仙台病毒載體 iPS 細胞，主要是為了滿足歐洲與北美的臨床使用規範，原始的周邊血液細胞樣本是由美國當地核可的醫療研究機構自美國的捐贈者進行採集和檢測 [9]。未來也計畫陸續推出更多的細胞株，以及進行 HLA 基因體編輯的 SeV-iPS 細胞，以滿足更多樣的使用者需求。

包含上篇提及的 HLA 同型合子 iPS 細胞庫，以及本篇的 HLA 基因體編輯細胞庫建立的策略和仙台病毒載體 iPS 細胞，都是屬於異體細胞來源的方法。另一方面，針對個人化醫療的概念，自體來源細胞理論上可以最小化免疫排斥性和外來細胞帶來的各種潛在風險，也是一種可行的做法。然而目前小規模的製備方法，除了耗時長、程序繁瑣外，製造成本也很高，技術上仍有許多問題尚待克服。因應自體細胞移植的需求，京都大學 iPS 細胞基金會也正努力推行一項新的計畫，將在下篇文章【細胞治療的彈藥庫－臨床級 iPS 細胞庫的建置 (下) 】繼續為大家介紹。

參考文獻：

1. Okita, K., Matsumura, Y., Sato, Y., Okada, A., Morizane, A., Okamoto, S., Hong, H., Nakagawa, M., Tanabe, K., Tezuka, K., Shibata, T., Kunisada, T., Takahashi, M., Takahashi, J., Saji, H., & Yamanaka, S. (2011). A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods, 8(5), 409-412. https://doi.org/10.1038/nmeth.1591
2. iPS Cell Stock Project – HLA-genome-edited iPS cells
   https://www.cira-foundation.or.jp/e/research-institution/ips-stock-project/genome-edited.html
3. Targeted disruption of HLA genes via CRISPR-cas9 generates iPSCs with enhanced immune compatibility.
   Xu, H., Wang, B., Ono, M., Kagita, A., Fujii, K., Sasakawa, N., Ueda, T., Gee, P., Nishikawa, M., Nomura, M., Kitaoka, F., Takahashi, T., Okita, K., Yoshida, Y., Kaneko, S., & Hotta, A. (2019). Cell Stem Cell, 24(4), 566-578.e7. https://doi.org/10.1016/j.stem.2019.02.005
4. Kitano, Y., Nishimura, S., Kato, T. M., Ueda, A., Takigawa, K., Umekage, M., Nomura, M., Kawakami, A., Ogawa, H., Xu, H., Hotta, A., Takasu, N., & Tsukahara, M. (2022). Generation of hypoimmunogenic induced pluripotent stem cells by CRISPR-cas9 system and detailed evaluation for clinical application. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development, 26, 15-25. https://doi.org/10.1016/j.omtm.2022.05.010
5. Research and Activity Reports: Clinical research using iPS cell stock. CiRA Foundation.
   https://www.cira-foundation.or.jp/e/research/clinical-trial.html
6. First shipment of the iPS cell stock to an overseas partner. (2021, June 1). CiRA Foundation.
   https://www.cira-foundation.or.jp/2021/06/01-105951.html
7. Provision of HLA Genome-edited iPS Cell Stock for Clinical Use. (2023, June 14). CiRA Foundation.
   https://www.cira-foundation.or.jp/2023/06/14-095600.html
8. iPS Cell Stock Project – SeV-iPS cells
   https://www.cira-foundation.or.jp/e/research-institution/ips-stock-project/sev-ips-cells.html
9. Provision of a New iPS Cell Line for Clinical Use (2023, April 5). CiRA Foundation.
   https://www.cira-foundation.or.jp/2023/04/05-130001.html

撰文｜藍冠鈞
審稿｜蕭皓文

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