不只是基因剪刀手！CRISPR 系統搭配氧化還原迴路以調控基因表現

有效率的訊息傳遞，對於生物調控自身的基因表現是非常重要的，但窺探其機制經常牽涉到資訊的本身與雜訊的干擾。因此，美國馬里蘭大學的 William E. Bentley 教授團隊建立一套可調控電誘導性 CRISPR（electrogenetic clustered regularly interspaced short palindromic repeats, eCRISPR）系統，將電子訊號轉化成生物可讀訊息。此團隊已於 2016 年建立一套以氧化還原（reduction and oxidation, redox）為基礎的電子訊息轉換裝置，藉由外部給予細菌間的抗菌素（pyocyanin，PYO）與外加電壓使大腸桿菌（E. coli）內的氧化壓力（oxidative stress）增加，而啟動調節蛋白 SoxR（SoxR regulator）進而表現有興趣之基因，如：綠螢光蛋白（phiLOV）[1]。在 2013 年，Marraffini 教授團隊發現若是針對 CRISPR 系統的 Cas9 進行修飾並接上 RNA 聚合酶的 ⍵ 次單元（deactivated Cas9-⍵，dCas9-⍵）會使 Cas9 喪失其剪切功能並轉而啟動目標基因的轉錄發生 [2]。另一篇 2017 年研究指出，E. coli 內部的 dCas9 失活剪切酶裝載針對 W108 序列進行結合的 gRNA，則可以增加 CRISPR-dCas9 複合物對於轉錄起始點（transcriptional start site ，TSS）上游的親和力，進而增加其下游基因的表現 [3]。William E. Bentley 教授團隊結合了前人的文獻與自身的研究，開發一套富有可利用電訊號調控的 eCRISPR 系統。

作者利用氧化的 PYO（PYO [O]）作為氧化還原的誘導劑（inducer）以及 ferricyanide (Fcn)/電極作為氧化還原訊號放大劑（amplifier）。隨著 E. coli 內的氧化壓力越大，guide RNA （gRNA）表現也會隨之增加，這些 gRNA 與 dCas9-⍵ 組裝後開始啟動 GFP（phiLOV）的表現（圖一 a）。隨著電極給予的電量增加，可觀察到 GFP 的表現增加，但在電量超過 -0.5 庫倫時會產生太強的氧化壓力毒性導致 GFP 表現下降（圖一 b）。給予 -0.4 庫倫的電量後培養四小時，則可以使 E. coli 表現最多的 GFP，培養超過四小時則可能因細胞進入停滯期（stationary phase）使 GFP 表現量下降（圖一 c）。除了 E. coli 內部的基因表現增加，作者也探討 eCRISPR 系統是否可以調控細菌間的溝通（quorum sensing，QS）。LasI （QS autoinducer-1 synthase）是一種不存在於 E. coli 的酵素，導入其基因進入 E. coli 後可以使其產生 autoinducer-1（AI-1），作為 AI-1 製造者（producer cell），E. coli 若是接受越多的電量，會產生更多的 AI-1；這些 AI-1 會促使 AI-1 接受者（reporter cell）產生生物冷光，經由換算，當電量給予 -0.06～-0.1 庫倫之間，最終 AI-1 表現量會有約 1.5 倍的上升（圖一 d），說明藉由 eCRISPR 系統可以開啟細菌本身不具有的基因迴路。綜合上述結果，以電極調控 CRISPR 系統是可以調控細菌內部的基因表達與細菌間的訊息傳遞。

圖一：電子調控性的CRISPR系統。（a）在 E. coli 內部，藉由 pSoxs 轉錄出 gRNA 進而將 dCas9-⍵ 轉錄活性開啟。（b）電極給予電量之後，gRNA 與 GFP RNA（phiLOV）的表達量。（c）電極給予不同電量後培養的時間也會影響螢光的強度。（d）透過分析 AI-1 的活性，展現 eCRISPR 也可以調控細菌間的交互作用。圖片來源：https://doi.org/10.1038/s41467-020-16249-x

E. coli 的基因組（genome）對於過度的氧化環境會有相對應的措施，藉由啟動 SoxR regulator 產生 SoxS 蛋白進而表現一系列抗自由基（reactive oxygen species，ROS）基因如：超氧化物歧化酶（SOD）。因此作者設計兩個 gRNA 可以辨認 SoxS promoter 下游的位置（S1 與 S2 gRNA），預期可以阻斷 SoxS 表現。從實驗結果發現，無論是使用一般的 dCas9 還是 dCas9-⍵ 都可以發揮 CRISPR inhibition 效果，相較於無特定序列的 gRNA（control gRNA），S1 與 S2 gRNA 皆可以抑制 SoxS 表現（圖二 a）。當 S1 gRNA 表現時，因為 soxS 蛋白表現受到抑制以至於其調控的的抗自由基酵素也無法被表達，因此使外加的氧化壓力無法被胞內抗氧化機制消除而大量提高 GFP 的表現，也說明了 S1 gRNA 有緘默 SoxS 表現的能力（圖二 b）。

圖二：eCRISPR 系統結合 S1/S2 gRNA 弱化來自基因組的雜訊干擾。（a）在氧化壓力存在下，不同的 dCas9 對於 S1/S2 gRNA 抑制 soxS 表現的能力。（b）整合 S1 gRNA 與 GFP 基因（phiLOV）對於螢光強度的影響。圖片來源：https://doi.org/10.1038/s41467-020-16249-x

綜合上述實驗結果，透過誘導劑（PYO [O]）以及放大劑（Fcn/電極）可以像開關一樣打開/關閉 gRNA 表現，而影響 dCas9-⍵ 的活性，進而決定多個基因是否同時表現或被抑制。由於 E. coli 會表現抗氧化基因以抑制氧化壓力，作者藉由插入一個 S1 gRNA 來緘默基因組的抗氧化基因，達到放大訊號的目的（圖三）。因此作者認為此 eCRISPR 系統旨在連接和控制生物傳訊網絡，並在合成生物學、生物技術和生物醫學等領域具有潛在應用，如：針對腸道菌叢設計含有可抑制 QS 的 eCRISPR 啟動子以及氧化還原化合物的電子膠囊，也許可以對腸道菌叢進行調節，避免腸道微生態失調（dysbiosis）的發炎情況 [4, 5]。此外氧化還原所建立的電子通道，或許也能應用到真核細胞中，如：藉由癌症所處的高氧化壓力環境 [6]，判斷電子的流向來開發癌症診斷的儀器或者是抗癌藥物，將基礎原理應用到更廣泛的層面上。

圖三：eCRISPR 系統的機制圖。1. PYO [O] 作為誘導劑，搶走 E. coli 內的電子。2. Fcn 與電極作為放大劑，進一步產生更強的氧化壓力。3. 氧化壓力調節子（soxR）開啟 soxS 啟動子而轉錄出許多 gRNA。4. 以四環黴素介導的啟動子（Tet promoter）持續表達 dCas9-⍵。5. dCas9-⍵ 與 gRNA 進行整合，而結合到 soxS 啟動子的上游位置。6. 被啟動的 soxS 啟動子轉錄出 GFP，而 S1 gRNA 則因為持續性啟動子，不斷地轉錄出 S1 gRNA。7. dCas9-⍵ 與 S1 gRNA 進行整合。8. dCas9-⍵:S1 gRNA 佔據基因組 soxS 啟動子的下游位置。9. 由於基因組 soxS 啟動子的下游位置被阻擋，而無法產生對抗自由基相關的基因。圖片來源：自繪

Main Article: Bhokisham, N., VanArsdale, E., Stephens, K. T., Hauk, P., Payne, G. F., & Bentley, W. E. (2020). A redox-based electrogenetic CRISPR system to connect with and control biological information networks. Nature communications, 11(1), 2427. https://doi.org/10.1038/s41467-020-16249-x

參考文獻：

Tschirhart, T., Kim, E., McKay, R., Ueda, H., Wu, H. C., Pottash, A. E., Zargar, A., Negrete, A., Shiloach, J., Payne, G. F., & Bentley, W. E. (2017). Electronic control of gene expression and cell behaviour in Escherichia coli through redox signalling. Nature communications, 8, 14030. https://doi.org/10.1038/ncomms14030
Bikard, D., Jiang, W., Samai, P., Hochschild, A., Zhang, F., & Marraffini, L. A. (2013). Programmable repression and activation of bacterial gene expression using an engineered CRISPR-Cas system. Nucleic acids research, 41(15), 7429–7437. https://doi.org/10.1093/nar/gkt520
Dong, C., Fontana, J., Patel, A., Carothers, J. M., & Zalatan, J. G. (2018). Synthetic CRISPR-Cas gene activators for transcriptional reprogramming in bacteria. Nature communications, 9(1), 2489. https://doi.org/10.1038/s41467-018-04901-6
Thompson, J. A., Oliveira, R. A., & Xavier, K. B. (2016). Chemical conversations in the gut microbiota. Gut microbes, 7(2), 163–170. https://doi.org/10.1080/19490976.2016.1145374
Wu, L., & Luo, Y. (2021). Bacterial quorum-sensing systems and their role in intestinal bacteria-host crosstalk. Frontiers in microbiology, 12, 611413. https://doi.org/10.3389/fmicb.2021.611413
Greenwood, H.E. and T.H. Witney. (2021). Latest advances in imaging oxidative stress in cancer. Journal of Nuclear Medicine, 62(11): p. 1506-1510. https://doi.org/10.2967/jnumed.120.256974