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【核力覺醒-細胞核感應外力,調控核內外物質運輸】

細胞,組成生物體的基本單元,不僅含有遺傳物質,也含有各種胞器組成的空間以進行物質交換。在真核細胞中,當要進行不同的基因表現或蛋白質製造,首要任務便是將各種材料以及控制基因表現起始的轉錄因子,運送到染色體所在的細胞核內部。而核膜本身不僅是物質屏障,也參與了移動過程的調控,並決定了在什麼環境下讓特定的轉錄因子順著濃度梯度被動擴散(Passive Diffusion或是進行促進性擴散(Facilitated Diffusion

其中,促進性擴散比被動擴散更為複雜,需要讓被運輸的分子和內輸蛋白(Importin)或外輸蛋白(Exportin)結合後進行,透過攜帶進核訊號(Nuclear Localization Signals, NLS)或出核訊號(Nuclear Export Signals, NES),使分子通過核膜上的核孔複合體(Nuclear Pore Complexes, NPCs)進出細胞核。 

近年來的研究結果發現,真核細胞可以透過微管、微絲以及肌凝蛋白等細胞骨架,進行對周遭環境的機械力感應(Mechanosensing(圖一)[1],並且調控 YAPYes-associated protein)以及 MyoDMyoblast Determination Protein)等細胞生長週期或分化的上游轉錄因子進出細胞核 [2, 3]。過去的研究證明了細胞骨架透過機械力感應改變蛋白質的磷酸化狀態,進而調控轉錄因子的移動。

圖一、真核細胞可以透過細胞骨架(Cytoskeleton),包括微管(Microtubule)、微絲(Actin)以及肌凝蛋白(Myosin)等進行對周遭環境的機械力感應並調控物質進出。圖片來源:doi: 10.1016/j.yexcr.2019.02.009

西班牙巴塞隆納科學技術學院的Dr. Pere Roca-Cusachs 團隊好奇細胞核膜是否能夠單純透過機械力感應,改變核孔複合體對不同大小、或是帶有不同強度進出核訊號的蛋白質的通透性。 

首先,為了研究核膜機械力感應對蛋白質被動擴散的影響,作者們製作了特殊的報導蛋白(Reporter Protein)系統。該系統由綠色螢光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)加上 1234 6 個不同數量的金黃色葡萄球菌蛋白 PrA Staphylococcus aureus Protein A)組成,每個 PrA 都是分子量 7 kDa、無細胞反應性、不影響GFP 活性,並且是單純被動擴散入核的小分子(圖二 a)。

圖二、(a)綠色螢光蛋白與金黃色葡萄球菌蛋白 PrA組成不同分子量的報導蛋白系統。(b、c)分子量或環境硬度不影響被動擴散下最終核內外螢光強度的比值。(d)螢光光漂白(FLIP)實驗結果。(e、f)當培養環境硬度越大,進出核速率越快,分子量增加後進出核速率趨於一致。圖片來源:doi: 10.1038/s41556-022-00927-7

透過在小鼠胚胎纖維母細胞內(Mouse embryonic fibroblasts)表現這個系統,並培養在 1.5 kPa 30 kPa 的不同環境硬度下,觀察細胞核內外 GFP 螢光強度的改變。藉由螢光光漂白(Fluorescence loss in photobleaching, FLIP實驗(圖二 d),作者們可以計算報導蛋白系統進出核的速率,並研究分子量及環境硬度的影響。實驗結果發現分子量及環境硬度皆不影響最終核內外螢光強度的比值(也就是報導蛋白的分布)(圖二 bc),但卻影響了報導蛋白進出核的速率。當培養環境硬度越大,進出核速率越快,但隨著分子量增加至約 41 kDa 以上,進出核速率就到了臨界值,不會再加快(圖二 ef)。

作者們接著想探討機械力感應和促進性擴散的動態關係,於是在前述的報導蛋白系統前端加上了低、中、高三個不同強度的進核訊號(圖三 a),並在不同環境硬度下觀察。這時有三個變因:訊號強度、分子量、環境硬度,為了簡化實驗,作者們由低強度訊號的 41 kDa 蛋白開始測試,並成功看到在較高硬度 30 kPa 的環境下,除了進出核速率都較快以外,最終累積在核內的訊號也較高(圖三 b)。進一步測試低強度訊號在不同分子量下機械力感應的結果,看到進核速率隨分子量增加而降低的趨勢較出核速率降低的趨勢緩慢(圖三 c),除了對應整體核內訊號增加的結果以外,也暗示了分子量增加與機械力感應程度為負相關。 

圖三、(a)報導蛋白系統前端加上低、中、高三個不同強度的進核訊號。(b)由低強度訊號的 41 kDa 蛋白開始測試,並看到在較高硬度 30 kPa 的環境下進出核速率都較快,最終累積在核內的訊號也較高。(c)低強度訊號在不同分子量下機械力感應的結果。圖片來源:修改至 doi: 10.1038/s41556-022-00927-7

綜合被動擴散與促進擴散的觀察,作者們提出了一個最終模型來預測分子量、進核訊號強度、機械力感應三個變因的關係。透過多種不同組合的實驗結果以及數學模型計算,他們發現在分子量低(小於 41 kDa )或進核訊號弱的情況下,被動擴散為主要運輸方式,反之,高分子量或進核訊號強的情況則以促進性擴散為主。而機械力感應則在兩者皆中等的區域扮演決定性的角色,並形成了一「機械力反應帶」。這個反應帶又可以透過計算量化,轉換成「機械力感應度-分子量-進核訊號強度」的關係圖(圖四)。 

圖四、左圖為分子量、進核訊號強度、機械力感應三個變項的關係模型,右圖為「機械力反應帶」轉換成「機械力感應度-分子量-進核訊號強度」的關係圖。圖片來源:doi: 10.1038/s41556-022-00927-7

最後,作者們嘗試對已知轉錄因子做人工變異,來控制分子進出核的程度。他們以 twist1 轉錄因子為標的,增加不同強度的進核訊號來調整 twist1 在細胞內的分布。結果顯示帶有不同強度的進核訊號使得twist1具有不同的機械力感應度,且受到機械力感應調控的核進出現象,是獨立於其他調控路徑的影響(圖五)。 

圖五、人工增加不同強度的進核訊號在 twist1 轉錄因子前可改變其機械力感應度,且受到機械力感應調控的核進出現象,獨立於其他調控路徑。圖片來源:doi: 10.1038/s41556-022-00927-7

這個研究除了展示細胞內原始且根本的物理現象,更大大地擴展了機械力感應在未來被應用於基因調控的可能性。舉凡器官發育、組織修復、免疫細胞浸潤、以及癌細胞生長等,無一不牽涉到環境硬度的改變和基因表現的控制。若能根據特定基因深入研究並了解「機械力感應度-分子量-進核訊號強度」的關聯,我們便可以對各種轉錄因子做修飾,在特定時間點打開或關閉基因表現,影響將非常深遠!

Main Article: 

Andreu, I., Granero-Moya, I., Chahare, N. R., Clein, K., Molina-Jordán, M., Beedle, A. E. M., Elosegui-Artola, A., Abenza, J. F., Rossetti, L., Trepat, X., Raveh, B., & Roca-Cusachs, P. (2022). Mechanical force application to the nucleus regulates nucleocytoplasmic transport. Nature Cell Biology, 24(6), 896. https://doi.org/10.1038/S41556-022-00927-7

參考文獻:

  1. Kassianidou, E., Kalita, J., & Lim, R. Y. H. (2019). The role of nucleocytoplasmic transport in mechanotransduction. Experimental Cell Research, 377(1–2), 86–93. https://doi.org/10.1016/J.YEXCR.2019.02.009
  2. Elosegui-Artola, A., Andreu, I., Beedle, A. E. M., Lezamiz, A., Uroz, M., Kosmalska, A. J., Oria, R., Kechagia, J. Z., Rico-Lastres, P., Le Roux, A. L., Shanahan, C. M., Trepat, X., Navajas, D., Garcia-Manyes, S., & Roca-Cusachs, P. (2017). Force Triggers YAP Nuclear Entry by Regulating Transport across Nuclear Pores. Cell, 171(6), 1397-1410.e14. https://doi.org/10.1016/J.CELL.2017.10.008
  3. Jacchetti, E., Nasehi, R., Boeri, L., Parodi, V., Negro, A., Albani, D., Osellame, R., Cerullo, G., Matas, J. F. R., & Raimondi, M. T. (2021). The nuclear import of the transcription factor MyoD is reduced in mesenchymal stem cells grown in a 3D micro-engineered niche. Scientific Reports, 11(1). https://doi.org/10.1038/S41598-021-81920-2

 

撰稿|凃昀吰(YunHung Tu
審稿|劉又萱

 



About the author

凃 昀吰 YunHung Tu

凃 昀吰 YunHung Tu

加州大學柏克萊分校傳染病免疫學博士生,Dr. Filipa Rijo-Ferreira 實驗室。研究領域為微生物、宿主及病媒在生理時鐘演化下的交互影響。

對全球衛生及被忽視的熱帶疾病充滿熱忱,希望透過分子醫學研究與了解社會文化的變動,幫助改善健康不平等。

熱愛排球、咖啡和音樂。

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