螢光蛋白（fluorescent protein）是生物學研究的重要工具，可用於追蹤蛋白質、觀察顯微結構，最初發現水母綠色螢光蛋白的學者們，甚至因此獲得2008年諾貝爾化學獎[1]。然而，最原始的綠色螢光蛋白並無法滿足現今各式螢光顯微成像的需求，因此衍伸出各式改造過的蛋白，也另外發展了橘色、藍色的選擇[2]。
螢光蛋白的亮度很重要，但只是會發亮還不夠，因為螢光蛋白其實會「見光死」，我們稱作光漂白（photobleaching）。激發態的螢光蛋白會與氧氣反應，使其失去螢光，連續曝光在雷射下十幾秒到幾分鐘之後，螢光訊號便降低到不堪使用的程度，這樣限制了研究人員可以觀察的時長，尤其是觀察活體細胞內的動態時，通常需要不停拍攝影像，穩定的螢光蛋白相形重要。雖然目前已發展出多款光穩定性較高的綠色螢光蛋白，但亮度不高，難以形成清晰的影像。
圖一、玉水母的的自然螢光。左圖為水螅體；右圖為水母體的微分干涉相差與螢光影像重疊。圖片來源：https://doi.org/10.1038/s41587-022-01278-2。
就在2022年的四月份，一顆閃亮的新星嶄露頭角了！日本理研光量子工學研究中心的平野雅彦研究員等人，從青葉縣近海的玉水母（Cytaeis uchidae,タマクラゲ）身上找出新款綠色螢光蛋白，暫且稱之為CU17S，其胺基酸序列和已知的水母螢光蛋白們都不怎麼像。CU17S不容易見光死，但是亮度稍嫌不足。研究團隊引入隨機的突變，經篩選之後，發現 V168A 突變能顯著提升亮度且維持優異的穩定性，於是這個分子被命名為StayGold。StayGold蛋白，比其他綠色螢光蛋白亮，且比常用的EGFP穩定超過二十倍（數值為光漂白半衰期9919秒：493秒），其亮度與照光時間的關係請見圖二。
圖二：各種螢光蛋白的亮度與照光時間的關係。可見StayGold的亮度遠比其他常見的螢光蛋白持久。圖片來源：https://doi.org/10.1038/s41587-022-01278-2。
到此為止，StayGold看起來是個好東西，但研究團隊嘗試將它表現在內質網（endoplasmic reticulum）卻遇到困難。因為StayGold含有多個半胱胺酸（cysteine）而導致形成不必要的雙硫鍵（disulfide bond），阻礙正確的蛋白質折疊。另外，StayGold的N端及C端都沒有足夠長的多餘胺基酸，導致連接上的多肽鏈容易干擾螢光性質。於是團隊刪除2個半胱胺酸、添加數個胺基酸至兩端，最後再加上內質網的識別片段，做成er-(n2)oxStayGold(c4)，證實可有效的表現於內質網中，見圖三。
圖三：使用er-(n2)oxStayGold(c4)標記的內質網。兩張前後拍攝的相片顯示在40分鐘後，螢光亮度仍相當穩定沒有衰退。圖片來源：https://doi.org/10.1038/s41587-022-01278-2。
最後，當然要實際試用看看這款新貨用在追蹤細胞動態的表現如何。er-(n2)oxStayGold(c4)能夠用在清晰地連續紀錄內質網影像。團隊證實減少鈣離子釋放時，比起靠近細胞中心位置，靠近細胞膜、較邊緣的內質網更具移動性（mobile）。其他細胞顯微結構，如粒線體、微管（microtubule），也都可以輕鬆被StayGold標記並發出螢光，甚至SARS-CoV-2在細胞內的運送及組裝過程都無所遁形。StayGold優異的亮度及光穩定性，確實能運用於超高解析度的動態顯微攝影，例如three-dimensional structured illumination microscopy (3D-SIM)、grazing incidence (GI)-SIM。未來，還需要持續改進StayGold，找出真正單體的（monomeric）螢光蛋白分子，這樣才能應用於膜蛋白或者定量個別的蛋白質表現。
Main Article：
Hirano, M. et al. A highly photostable and bright green fluorescent protein. Nat Biotechnol 40, 1132–1142 (2022). https://doi.org/10.1038/s41587-022-01278-2
參考文獻：
- Shimomura, O., Johnson, F. H. & Saiga, Y. Extraction, Purification and Properties of Aequorin, a Bioluminescent Protein from the Luminous Hydromedusan, Aequorea. Journal of Cellular and Comparative Physiology 59, 223–239 (1962). https://doi.org/10.1002/jcp.1030590302
- Ai, H., Shaner, N. C., Cheng, Z., Tsien, R. Y. & Campbell, R. E. Exploration of new chromophore structures leads to the identification of improved blue fluorescent proteins. Biochemistry 46, 5904–5910 (2007). https://doi.org/10.1021/bi700199g
撰文｜王振宇
審稿｜劉又萱
