打破沉默的磷酸枷鎖：PhosTAC 技術為 Tau 開啟自由之路

Tau 蛋白是神經退化性疾病（如阿茲海默症、皮克氏症等）的研究中，最常被探討的標靶之一 [1]。Tau 主要表達於神經元中，具有穩定微管結構的功能。然而，它屬於無序蛋白（intrinsically disordered protein），過度磷酸化時容易失去穩定性，進而形成異常聚集，導致神經毒性。

Tau 受多種轉譯後修飾（Post-translational modification，PTM），其中一種是磷酸化，而過度磷酸化在阿茲海默症患者的腦組織中相當常見。過去的研究顯示，Tau 上的 Thr231 位點的磷酸化會造成構形改變促使其聚集為成對螺旋絲（Paired helical filaments，PHF）。此外，Ser262、Ser356 位點的磷酸化會妨礙其被 CHIP－HSP90 複合體（註一）識別，進而無法進入蛋白酶降解，造成毒性累積 [2]。此外，Tau 的磷酸化狀態還會改變其細胞定位，使其從軸突（axon）錯誤轉移到樹突（dendrite）區域，進一步加劇神經功能障礙 [4]。

PP2A（Protein Phosphatase 2A，註二）是主要參與 Tau 去磷酸化的酵素，約占整體去磷酸化活性 70%，被視為重要的治療靶點 [3]。耶魯大學 Craig Crews 教授的研究團隊過去已發展出 PhosTAC（Phosphorylation-Targeting Chimera）技術，這是一種能同時結合標的蛋白與去磷酸酶的小分子，過去研究已被證實能與 PDCD4 （註三）與 FOXO3a（註四）等去磷酸化蛋白結合 [5]。

本篇研究使用 PhosTAC 的技術作為橋樑讓 Tau 蛋白與 PP2A 酵素結合，能有效引導 PP2A ，使其去磷酸化 Tau 蛋白，讓 Tau 蛋白的功能恢復正常。該研究團隊設計兩種 PhosTAC 分子分別是：PhosTAC7 和 PhosTAC7F（圖一），能用來幫助選擇性地結合 Tau 蛋白。兩者在結構上有一點點差異，PhosTAC7 具有活性能招募 PP2A 到 Tau 蛋白，而 PhosTAC7F 則是無法招募 Tau 蛋白的不具活性分子。

圖一、本篇論文中所設計的兩種 PohsTAC 分子：PhosTAC7 和 PohsTAC7。前者是有活性的，而後者是無活性的。圖片來源：https://doi.org/10.1021/jacs.2c11706。

為了驗證 PhosTAC7 能夠使得 Tau 蛋白進行磷酸化，首先，研究團隊利用 HaloTrap 技術（註五），確認只有在加入 PhosTAC7 時，Tau 蛋白才能與 PP2A 形成穩定的三元錯合物（圖二A）。而作為對照組的 PhosTAC7F 則無法與 PP2A 形成錯合物。接著，為了檢測 PhosTAC7 去磷酸化的效果，他們檢測了Tau 上 T231 和 T181 兩個常見修飾位典的磷酸化程度，結果顯示 Tau 上 pT231 和 pT181 的磷酸化程度明顯地下降（圖二B）。最後，為了確認 PhosTAC7 確實是需要 PP2A 的幫助來進行去磷酸化，加入 PP2A 抑制劑 okadaic acid 後，PhosTAC7 的去磷酸化效果明顯受到抑制，證明PhosTAC7 真的是透過 PP2A 來進行去磷酸化（圖二 C）。

總結來說，PhosTAC7 具有高度專一性與機制依賴性，能精準引導 PP2A 對 Tau 蛋白進行去磷酸化。

圖二、（A）確認 PhosTAC7 和 PhosTAC7F 與 PP2A 的結合能力。利用 HaloTrap，發現只有 PhosTAC7 能穩定拉下 tau–PP2A 複合物，PhosTAC7F 無法結合。（B）測試不同濃度的 PhosTAC7 下，tau 的 Thr231 和 Thr181 位點去磷酸的程度 PhosTAC7 從 0.25 μM 起即明顯降低 pT231 和 pT181 磷酸化，最大抑制率約 75%；PhosTAC7F 無效。（C）驗證去磷酸化作用是否依賴 PP2A 活性加入 PP2A 抑制劑 okadaic acid 後，PhosTAC7 去磷酸化效果消失，證明其作用需仰賴 PP2A。圖片來源：https://doi.org/10.1021/jacs.2c11706。

為了進一步驗證 PhosTAC7 是否能有效促進 Tau 蛋白去磷酸化並與 PP2A 形成穩定錯合物，研究團隊運用採用名為資料獨立擷取質譜（data-independent acquisition mass spectrometry，DIA-MS）的蛋白質體學技術，分析 PhosTAC7 是否增加與 Tau 蛋白交互作用。首先，他們分析 Tau 上三個常見的磷酸化位點：T181、T231 和 S202。結果顯示，經 PhosTAC7 處理後，這些磷酸化位點的修飾程度顯著下降（圖五 A-D），證明 PhosTAC7 確實具有促進 Tau 去磷酸化的功能。

接著，透過 DIA-MS 分析，團隊發現 PhosTAC7 能顯著與 PP2A 三個組成亞基形成錯合物：PPP2R1A、PPP2C 與 PPP2R2A（圖五 E）。此外，由於 Tau 與微管蛋白（tubulin）會互相作用，以維持微管穩定，其 DIA-MS 的分析結果顯示微管蛋白與 Tau 的結合能力有提升（圖五 F）。結果顯示 Tau 成功去磷酸化後，能繼續參與微管的調控，使其維持穩定。

這些質譜數據進一步支持 PhosTAC7 能夠引導 PP2A 去磷酸化 Tau，並能恢復其穩定微管功能，展現其在阿茲海默症等神經退化疾病中應用的潛力。

圖三、（A-C）使用資料獨立擷取質譜技術（DIA-MS）分析 phosTAC7 去磷酸化的能力強弱（D）圖中藍色越深表示去磷酸化效果越明顯，顯示 PhosTAC 能有效針對多個位點發揮作用。（E）橘色越深代表被 HaloTrap 技術純化下來的 PP2A 三個亞基越多（F）橘色加深代表 Tau 與微管蛋白的結合越強。圖片來源：https://doi.org/10.1021/jacs.2c11706。

本研究驗證了 PhosTAC 技術能夠有效地將內源性磷酸酶 PP2A 精確募集至過度磷酸化的 tau 蛋白上，進而促進pT181、pT231 與 pS202等位點的的磷酸化水平顯著下降。此技術不僅避開傳統激酶抑制劑的毒性與非專一性問題，也為未來發展針對與 Tau 相關的神經性疾病提供嶄新治療策略。

註一：CHIP-HSP90：CHIP（C terminus of Hsc70-Interacting Protein）是一種 E3 泛素連接酶（ubiquitin ligase），能夠與分子伴護蛋白 HSP90 形成複合體，能夠辨識錯誤摺疊蛋白質並進行降解。

註二：PP2A（Protein Phosphatase 2A）是一種絲胺酸/蘇胺酸去磷酸酶（Ser/Thr phosphatase），在細胞中調控蛋白質的去磷酸化。

註三：PDCD4（Programmed Cell Death 4）是一種腫瘤抑制蛋白（tumor suppressor protein），具有調控細胞的生長、凋亡與轉譯等功能。

註四：FOXO3a 是一種轉錄因子，能啟動與抗氧化、自噬與細胞凋亡有關的基因，調節細胞對壓力的反應與壽命延長。註五：HaloTrap 技術是一種蛋白質純化與交互作用分析的方法，藉由將目標蛋白與 HaloTag 融合表現，可使用專一性樹脂將該融合蛋白從細胞裂解液中拉下（pull-down），同時捕捉其結合蛋白。此技術具備高特異性與低背景的優點，常與質譜分析搭配，用以鑑定蛋白質複合體的成分。研究中，HaloTrap 被用來純化 Tau 蛋白與其結合夥伴，進一步驗證 PhosTAC 介導下 Tau 的去磷酸化效果與與 PP2A、微管蛋白的交互作用，提供精確且可重現的蛋白層級證據。

Main Article:
Hu, Z., Chen, P. H., Li, W., Douglas, T., Hines, J., Liu, Y., & Crews, C. M. (2023). Targeted Dephosphorylation of Tau by Phosphorylation Targeting Chimeras (PhosTACs) as a Therapeutic Modality. Journal of the American Chemical Society, 10.1021/jacs.2c11706. Advance online publication. https://doi.org/10.1021/jacs.2c11706

參考文獻：

Lee, G., Cowan, N., & Kirschner, M. (1988). The primary structure and heterogeneity of tau protein from mouse brain. Science (New York, N.Y.), 239(4837), 285–288. https://doi.org/10.1126/science.3122323
Iqbal, K., del C. Alonso, A., Gong, C. X., Khatoon, S., Pei, J. J., Wang, J. Z., & Grundke-Iqbal, I. (1998). Mechanisms of neurofibrillary degeneration and the formation of neurofibrillary tangles (pp. 169-180). Springer Vienna. https://doi.org/10.1007/978-3-7091-6467-9_15
Gong, C. X., Singh, T. J., Grundke‐Iqbal, I., & Iqbal, K. (1993). Phosphoprotein phosphatase activities in Alzheimer disease brain. Journal of neurochemistry, 61(3), 921-927. https://doi.org/10.1111/j.1471-4159.1993.tb03603.x
Bramblett, G. T., Goedert, M., Jakes, R., Merrick, S. E., Trojanowski, J. Q., & Lee, V. M. (1993). Abnormal tau phosphorylation at Ser396 in Alzheimer’s disease recapitulates development and contributes to reduced microtubule binding. Neuron, 10(6), 1089-1099. https://doi.org/10.1016/0896-6273(93)90057-X
Chen, P. H., Hu, Z., An, E., Okeke, I., Zheng, S., Luo, X., … & Crews, C. M. (2021). Modulation of phosphoprotein activity by phosphorylation targeting chimeras (PhosTACs). ACS chemical biology, 16(12), 2808-2815. https://doi.org/10.1021/acschembio.1c00693