CRISPR 基因體學

CRISPR技術之改良及應用

CRISPR 可在活體細胞內進行基因編輯,是目前生命科學領域最熱門的技術之一,在基礎研究、生物科技、及臨床醫學上都有許多應用。CRISPR 的全名為「群聚、規律間隔的短回文重複序列」(clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats, CRISPR),運作原理為應用細菌後天免疫機制,消滅入侵的質體或噬菌體,並將外來基因片段留在本身基因組中作為記憶。以 CRISPR-Cas9 為例,Cas9 內切酶會與其導引 RNA(guide RNA)結合,並藉由導引 RNA 與 DNA 序列的配對而可辨認目標序列並切割 DNA。因此,透過修改導引 RNA 的序列,可改變欲修改之 DNA 序列。自從 CRISPR 技術被提出後,許多研究也不斷地發展與優化此技術,包括改善其 DNA 專一性(DNA specificity)及產物選擇性(product selectivity)等。

改良 DNA 專一性的方法有許多種(圖一),如:使用基因工程製造的 HFCas9 和 eCas9 可以減少蛋白質與 DNA 間非專一的靜電交互作用(圖一 C);使用本身具有較高的專一性(與 SpCas9 相比)的酵素如 Cpf1(圖一 D);利用兩個 Cas9 nickase 酵素或是 dCas9-FokI 融合,使得 DNA 的切割需要兩個 RNA 結合同時發生,可增加專一性(圖一 E, F);另外,減少 Cas9 活化的時間可減少細胞本身調控目標序列的機會,因此一些運用小分子來調控 Cas9 之活化時間也可有效增加專一性(圖一 G, H)。

由於許多基因編輯技術包括 CRISPR 皆進行雙股 DNA 的切割,其中一個主要的限制為如使用非同源性末端接合(non-homologous end joining, NHEJ)造成 DNA 修復時隨機的缺失(deletion)或插入(insertion)。雖然有些應用上仰賴這些隨機的的插入或缺失來干擾基因功能,許多研究需要精準地進行基因編輯,同源基因引導修復(Homology-directed repair, HDR)提供了一個修復的模板。因此,在產物選擇性方面,科學家們也提出了許多不同的改良方法(圖二),如使用小分子來抑制非同源性末端接合以及提升同源基因引導修復(圖二 D)。

這些改良讓CRISPR技術被廣泛運用在生命科學的在基礎研究、生物科技、及臨床上。其中最主要的應用之一為生產基因轉殖之生物與疾病的細胞株,包括基因剔除等,幫助科學家研究特定基因之功能。其他應用如在人類初代細胞培養進行基因編輯與遺傳性疾病之治療等,為生命科學研究及醫療發展帶來許多前所未有的新機會。

 

沒有自動替代文字。

圖一、利用各種不同策略提升 Cas9 蛋白對 DNA 序列的專一性 (圖片來源:https://www.cell.com/action/showImagesData?pii=S0092-8674%2816%2931465-9

沒有自動替代文字。

圖二、不同方法讓增加 DNA 序列修飾的選擇性(圖片來源:https://www.cell.com/action/showImagesData?pii=S0092-8674%2816%2931465-9

參考資料:
1. Komor, A., Badran, A. and Liu, D. (2017). CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell, 168(1-2), pp.20-36.

圖片來源:Figure 2 and 3 of Komor, A., Badran, A. and Liu, D. (2017). CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell, 168(1-2), pp.20-36.

撰文|李岱穎
修訂|蔡京庭

About the author

李岱穎

目前在英國牛津大學攻讀神經科學博士,主要研究興趣為系統與計算神經科學。對科普活動充滿熱忱,目前為 Pint of Science Event Manager、eLife 大使、以及 ENCODS (European Neuroscience Conference by Doctoral Students) 籌辦人等。希望能透過 Investigator 的平台和不同領域的人互相交流,並在臺灣推廣科學。

Leave a Comment