CRISPR 免疫學 基因與基因體學 微生物與免疫學

青出於藍的師徒過招!微生物免疫學家相繼找出CRISPR抑制蛋白

CRISPR-Cas9 基因剪輯系統以其高效率標靶剪切基因而聞名,隨著學界對其背後機制的探討與了解,目前發展了更多優化版本,也在不同物種之中找到不同特性的 CRISPR ,甚至是不同功能的變體系統。藉由 CRISPR 系統獨特的標靶能力以及透過 small-guide RNA(sgRNA)的引導,科學家得以更加精確地剪切基因;甚至能利用去活性 Cas9(dCas9)的 DNA 結合能力,調控下游基因表達(Transcription repression and activation)與表觀遺傳狀態(epigenetic regulation)[1-3]。然而,現今仍缺乏針對 Cas9 核酸酶調控的方式,其中以對抑制 Cas9 活性的方式尤為缺乏。如果 Cas9 在遞送到細胞內後無法適時關閉其表現,則可能引起脫靶現象累積(off-target accumulation),造成基因剪切錯誤愈發嚴重,或造成體內細胞剪切程度不一的鑲嵌基因型個體(Mosaic genotype),更甚者可能會引起生態層面無法預期的長遠影響。因此,微生物學家相繼加入開發調控 Cas9 的行列,並試圖以外加光或藥物來調控 Cas9 的活性 [4],但目前仍無法以內部遺傳調控的方式關閉(Off-switch)。

 

圖一、Anti-CRISPR登上當期封面(來源:Cover photo, Cell, 167.7 (2016).)

於 2016 年 12 月,多倫多大學的 Dr. Davidson 團隊發現了 Type-II CRISPR 抑制物並於 Cell 期刊發表了相關成果 [5],並成為當期的封面文章(如圖一)。該團隊率先於 2013 年以 Dr. Bondy-Denomy [6] 及 2014 年以 Dr. Pawluk [7](恰好是本篇 Cell 文章的第一作者)為首,發表了數個 Type-I CRISPR 抑制物,但 Type-I CRISPR 的分子機制較為複雜而難以應用。然而,該團隊依循前作的經驗,發現這些來自噬菌體目的在於反制細菌的免疫系統的微小蛋白的 anti-CRISPR (acr) 編碼。此外,這些 acr 基因會存在於潛溶噬菌體 (prophage)造成的可動遺傳因子(mobile genetic elements, MGEs)之中,也會編碼於其所保護的關聯基因(anti-CRISPR-associated gene, Aca)上游。基於紅后理論(Red Queen theory),寄生物與宿主間會如軍備競賽般共演化競爭,該團隊大膽預測 Type-II CRISPR 抑制蛋白的存在,並在 Nelsseria meningitidis 菌中成功找到三個針對 type-II-C CRISPR 的 acrIICNme 基因。這些 acrIICNme 基因不但可以在實驗環境中 (in vitro)抑制 N. meningitides Cas9 (NmeCas9) 的活性,也可以在人類細胞內有效重現其抑制功能。進一步地,該團隊解析了背後的抑制機制為阻斷 NmeCas9 蛋白與 DNA 結合,同時證實這些 acrIICNme 基因也可應用於調控 dNmeCas9 相關的工具(如圖二)。最後,結合經驗法則與生物資訊分析預測,該團隊預測類似的 Anti-CRISPR 系統有望廣泛存在於許多不同菌種當中,為這一精彩的章節留下耐人尋味的伏筆。

圖二、acrIICNme 基因可透過阻斷 Cas9 與 DNA 的結合,於細菌與人類細胞中抑制 Cas9 剪切DNA的活性(圖片來源:Cell, 167.7 (2017): 1829-1838.)

然而, NmeCas9 雖然有諸多優化特性,卻非現行最為常見且使用的 CRISPR-Cas9 系統,Streptococcus pyogenes Cas9 (SpyCas9) 由於其簡便以及有完整的研究 [8],反而是目前最為熟知而且廣泛應用的 CRISPR-Cas9 系統,使得 acrIICNme 的應用留下了缺憾。但這樣的缺憾並沒有持續太久,短短一個月之後,甫自 Dr. Davidson 團隊來到加州大學舊金山分校成立新團隊的 Dr. Bondy-Denomy,透過比對細菌基因體和篩選兼具有 CRISPR 回文間序列(spacer)與其對應標靶(complimentary target)的菌株立刻補上了這空白的扉頁!。這些菌株由於帶有 prophage 序列而成為被潛溶細菌(lysogens),意味著這些細菌若使 Cas9 正常運作,將會剪切本身基因體而造成自體免疫。因此,這之間必然存在著 anti-CRISPR 阻撓 Cas9 的運作,避免了死亡卻也犧牲了往後對同種噬菌體的抗性(如圖三 [9])。此團隊透過上述條件與生物資訊分析,成功在 Listeria monocytogenes 菌中找到四個新的 Type-II A CRISPR Cas9 抑制基因 (acrIIA),其中 AcrIIA2 及 AcrIIA4 蛋白更可成功作用於 SpyCas9,並印證其成功運作於 Escherichia coli 及人類細胞當中,此成果也發表於新一期的 Cell 期刊 [10](如圖四)。

圖三、Rauch, Benjamin J. 等人所提出的抗自體免疫系統(圖片來源:Cell 168.1 (2017): 9-11.)

與 CRISPR 相關的研究與報導,於近五年如火如荼地產出,短時間(甚至同時間)相繼發表的例子屢見不鮮,如同這次報導的師承關聯,尤其有趣和精彩。在關注嶄新生物學時,注意到背後作者們的合作與傳承,不嘗是讓人讀來既興奮又會心一笑的弦外之音。

 

圖四、自 L. monocytogenes 中分離的 AcrIIA 可有效阻斷Cas9,並可廣泛應用於 E. coli 與人類系統(圖片來源:Cell 168.1 (2017): 150-158.)

參考資料:

  1. Komor, A. C., Badran, A. H. and Liu, D. R. (2017) CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell, 168(1), 20-36. doi:10.1016/j.cell.2016.10.044
  2. Sander, J. D., & Joung, J. K. (2014) CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology, 32(4), 347-355. doi:10.1038/nbt.2842
  3. Dominguez, A. A., Lim, W. A. & Qi, L. S. (2015) Beyond editing: repurposing CRISPR-Cas9 for precision genome regulation and interrogation. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 17, 5-15 doi:10.1038/nrm.2015.2
  4. Nuñez, J. K., Harrington, L. B., and Jennifer A. Doudna. (2016) Chemical and biophysical modulation of Cas9 for tunable genome engineering. ACS chemical biology, 11(3), 681-688. doi:10.1021/acschembio.5b01019
  5. Pawluk, A. et al. (2016) Naturally Occurring Off-Switches for CRISPR-Cas9. Cell, 167(7), 1829-1838.
    doi:10.1016/j.cell.2016.11.017
  6. Bondy-Denomy, J. et al. (2013) Bacteriophage genes that inactivate the CRISPR/Cas bacterial immune system. Nature, 493, 429-432. doi:10.1038/nature11723
  7. Pawluk, A. et al. (2014) A new group of phage anti-CRISPR genes inhibits the type IE CRISPR-Cas system of Pseudomonas aeruginosa. MBio, 5(2) : e00896-14. doi:10.1128/mBio.00896-14.
  8. Jinek, M., et al. (2012) A programmable dual-RNA–guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science, 337, 816-821. doi:10.1126/science.1225829
  9. Carter, J., Hoffman, C. &  Wiedenheft, B. (2017) The Interfaces of Genetic Conflict Are Hot Spots for Innovation. Cell, 168(1), 9-11. doi:10.1016/j.cell.2016.12.007
  10. Rauch, Benjamin J., et al. (2017) Inhibition of CRISPR-Cas9 with Bacteriophage Proteins. Cell, 168(1)  150-158. doi:10.1016/j.cell.2016.12.009

撰文|陳尚甫
修訂|蔡京庭

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陳尚甫

台大生科系畢業,目前就讀台大分子細胞學研究所碩士班二年級,由Investigator元老級創辦人黃筱鈞老師與中研院基因體中心呂仁老師共同指導。目前主要在中研院生醫所幹細胞核心實驗室出沒,參與題目主要以human somatic stem cell reprogramming與transdifferentiation為主。由於先前在不同實驗室見習 對合成生物學、發育生物學、再生醫學與臨床生醫工程都稍有涉獵與興趣,期待與大家交流,跨領域迸發新想法!

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