青出於藍的師徒過招！微生物免疫學家相繼找出CRISPR抑制蛋白

CRISPR-Cas9 基因剪輯系統以其高效率標靶剪切基因而聞名，隨著學界對其背後機制的探討與了解，目前發展了更多優化版本，也在不同物種之中找到不同特性的 CRISPR ，甚至是不同功能的變體系統。藉由 CRISPR 系統獨特的標靶能力以及透過 small-guide RNA（sgRNA）的引導，科學家得以更加精確地剪切基因；甚至能利用去活性 Cas9（dCas9）的 DNA 結合能力，調控下游基因表達（Transcription repression and activation）與表觀遺傳狀態（epigenetic regulation）[1-3]。然而，現今仍缺乏針對 Cas9 核酸酶調控的方式，其中以對抑制 Cas9 活性的方式尤為缺乏。如果 Cas9 在遞送到細胞內後無法適時關閉其表現，則可能引起脫靶現象累積（off-target accumulation)，造成基因剪切錯誤愈發嚴重，或造成體內細胞剪切程度不一的鑲嵌基因型個體（Mosaic genotype），更甚者可能會引起生態層面無法預期的長遠影響。因此，微生物學家相繼加入開發調控 Cas9 的行列，並試圖以外加光或藥物來調控 Cas9 的活性 [4]，但目前仍無法以內部遺傳調控的方式關閉（Off-switch）。

 

於 2016 年 12 月，多倫多大學的 Dr. Davidson 團隊發現了 Type-II CRISPR 抑制物並於 Cell 期刊發表了相關成果 [5]，並成為當期的封面文章（如圖一）。該團隊率先於 2013 年以 Dr. Bondy-Denomy [6] 及 2014 年以 Dr. Pawluk [7]（恰好是本篇 Cell 文章的第一作者）為首，發表了數個 Type-I CRISPR 抑制物，但 Type-I CRISPR 的分子機制較為複雜而難以應用。然而，該團隊依循前作的經驗，發現這些來自噬菌體目的在於反制細菌的免疫系統的微小蛋白的 anti-CRISPR (acr) 編碼。此外，這些 acr 基因會存在於潛溶噬菌體 （prophage）造成的可動遺傳因子（mobile genetic elements, MGEs）之中，也會編碼於其所保護的關聯基因（anti-CRISPR-associated gene, Aca）上游。基於紅后理論（Red Queen theory），寄生物與宿主間會如軍備競賽般共演化競爭，該團隊大膽預測 Type-II CRISPR 抑制蛋白的存在，並在 Nelsseria meningitidis 菌中成功找到三個針對 type-II-C CRISPR 的 acrIICNme 基因。這些 acrIICNme 基因不但可以在實驗環境中 (in vitro)抑制 N. meningitides Cas9 (NmeCas9) 的活性，也可以在人類細胞內有效重現其抑制功能。進一步地，該團隊解析了背後的抑制機制為阻斷 NmeCas9 蛋白與 DNA 結合，同時證實這些 acrIICNme 基因也可應用於調控 dNmeCas9 相關的工具（如圖二）。最後，結合經驗法則與生物資訊分析預測，該團隊預測類似的 Anti-CRISPR 系統有望廣泛存在於許多不同菌種當中，為這一精彩的章節留下耐人尋味的伏筆。

然而， NmeCas9 雖然有諸多優化特性，卻非現行最為常見且使用的 CRISPR-Cas9 系統，Streptococcus pyogenes Cas9 (SpyCas9) 由於其簡便以及有完整的研究 [8]，反而是目前最為熟知而且廣泛應用的 CRISPR-Cas9 系統，使得 acrIICNme 的應用留下了缺憾。但這樣的缺憾並沒有持續太久，短短一個月之後，甫自 Dr. Davidson 團隊來到加州大學舊金山分校成立新團隊的 Dr. Bondy-Denomy，透過比對細菌基因體和篩選兼具有 CRISPR 回文間序列（spacer）與其對應標靶（complimentary target）的菌株立刻補上了這空白的扉頁！。這些菌株由於帶有 prophage 序列而成為被潛溶細菌（lysogens），意味著這些細菌若使 Cas9 正常運作，將會剪切本身基因體而造成自體免疫。因此，這之間必然存在著 anti-CRISPR 阻撓 Cas9 的運作，避免了死亡卻也犧牲了往後對同種噬菌體的抗性（如圖三 [9]）。此團隊透過上述條件與生物資訊分析，成功在 Listeria monocytogenes 菌中找到四個新的 Type-II A CRISPR Cas9 抑制基因 (acrIIA)，其中 AcrIIA2 及 AcrIIA4 蛋白更可成功作用於 SpyCas9，並印證其成功運作於 Escherichia coli 及人類細胞當中，此成果也發表於新一期的 Cell 期刊 [10]（如圖四）。

與 CRISPR 相關的研究與報導，於近五年如火如荼地產出，短時間（甚至同時間）相繼發表的例子屢見不鮮，如同這次報導的師承關聯，尤其有趣和精彩。在關注嶄新生物學時，注意到背後作者們的合作與傳承，不嘗是讓人讀來既興奮又會心一笑的弦外之音。