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第三代定序 — Oxford nanopore 技術及原理

提到三代定序,不外乎指 Pacific BioSciences (PacBio) 的單分子即時定序(single-molecule real-time sequencing, SMRT)以及 Oxford Nanopore Technologies 的奈米孔定序(nanopore-based platform)。其優點在於能夠讀取較長序列提高連續序列片段長度、定序速度快,且能直接對原始 DNA 樣本進行定序,避免了 PCR 擴增出現的錯誤率及偏好性 [1]。SMRT 的原理請見上一篇 第三代定序 — SMRT 技術及原理,這篇來介紹奈米孔定序法(nanopore sequencing)。

和 SMRT 的優點相同,奈米孔定序法可以讀取長片段序列並且即時分析數據。Nanopore 技術的核心為插在薄膜上的跨膜蛋白,並在薄膜的兩端加上電位差,使溶液的離子通過跨膜蛋白形成電流。解旋酶(helicase)將待測的 DNA 帶到跨膜蛋白上,並解開DNA兩股,使其中單股 DNA 通過跨膜蛋白。此時通過奈米孔的 DNA 會對離子流動造成阻礙,使電流改變 [2]。因為不同鹼基會對電流改變產生不同影響,藉由量測大量已知序列造成的電流大小變化,可以用電流改變的模式來回推 DNA 的鹼基。其定序速度相當於 DNA 通過奈米孔洞的速度,約每秒 250 到 450 個鹼基。以其產品 MinION 為例,在 24 小時內能產生超過 5 Gb 的數據,且事前處理、製備建庫只需 10 分鐘 [3]。

圖片來源: https://ppt.cc/fMoZsx

Nanopore 也有許多缺點有待改善,例如當穿膜孔不通孔洞破裂或多孔情況,皆會使電流的量測失準。另外,其使用電流大小變化來回推鹼基的粗錯誤率仍然相當高(一開始曾高達 30%,現在已降到 2-13%)。下方影片簡單介紹了他的原理。

值得一提的是,最近研究者發現 Nanopore 也能用來偵測表觀遺傳標記。他們使用稱做隱藏式馬可夫模型(hidden Markov models)的統計模型來計算鹼基序列,透過比較甲基化與一般的鹼基所產生的電流些微差異,可以檢測定序的鹼基是否有甲基化。不過目前的研究仍有幾個挑戰:第一、目前只能檢測 CpG 甲基化。第二、目前的訓練模型仍無法區分一段短序列(k-mers)中各自鹼基的甲基化情形,亦即他只能判斷這段序列是否全為甲基化/未甲基化 [4]。相信未來更多的研究與數據能逐漸克服這些難題。

目前,三代定序儀器逐步實現了穩定性、小型化,價格持續下降,分析軟體也不斷改進。Oxford nanopore 產品當中最受矚目的為 MinION,有著不到 100 克的重量,攜帶方便,有利於深入疫區的研究 [2]。在 2014 年非洲伊波拉病毒爆發時,需要在極短時間內了解病毒序列及診斷,MinION 就派上了他的用場 [5]。相信隨著準確度提升、通量不斷加大,技術會越來越成熟,應用領域也將不斷擴大,三代定序技術是未來的發展趨勢,實現大規模商業化將是大勢所趨。

參考文獻

  1. Nanopore sequencing The application and advantages of long-read nanopore sequencing to structural variation analysis-nanoporetech(2017) https://ppt.cc/fcRfHx
  2. Oxford Nanopore Technologies. (n.d.). Retrieved from https://nanoporetech.com/
  3. Highlights of Clive G Brown’s Technical Update. (2018, January 5). Retrieved from https://nanoporetech.com/about-us/news/highlights-clive-g-browns-technical-update
  4. Simpson, J. T., Workman, R. E., Zuzarte, P. C., David, M., Dursi, L. J., & Timp, W. (2017). Detecting DNA cytosine methylation using nanopore sequencing. Nature methods14(4), 407.
  5. Hoenen, T., Groseth, A., Rosenke, K., Fischer, R. J., Hoenen, A., Judson, S. D., … & Wollenberg, K. R. (2016). Nanopore sequencing as a rapidly deployable Ebola outbreak tool. Emerging infectious diseases22(2), 331.

撰文│高唯真
審稿│紀威佑

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高唯真

日本東北大學研究所。目前努力適應日本生活以及學習日文,主要專攻癌症方面基因和蛋白質的表達。對於細胞生物方面充滿的熱情及好奇,希望藉由Investigator 能與各不同領域的朋友一起學習交流。

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