基因與基因體學 科學報導 表觀遺傳學

單一細胞 DNA 甲基化分析方法:全基因體亞硫酸鹽定序

DNA 甲基化(DNA methylation)[1] 是種常見、也是研究最多的表觀遺傳調控方法,透過 DNA 甲基轉移酶(methyltransferase)添加甲基團於胞嘧啶( C)(或腺嘌呤( A))上,形成 5-甲基胞嘧啶(5mC),可在不改變 DNA 序列、但改變結構的情況下,調控基因表現;掌握甲基化基因體的實驗方法,對於其作用機制與模式的了解,以及如何應用於作物開發或疾病探索相當重要,本文將介紹亞硫酸鹽轉換(bisulfite-induced modification)和衍生的定序方法―單一細胞亞硫酸鹽定序法(single cell bisulfite sequencing, scBS-seq)等研究方法。

Frommer 等人於 1992 年發表亞硫酸鹽轉換的方式 [2]:未被甲基化的胞嘧啶會被亞硫酸鹽脫氨並轉換為尿嘧啶( U),5-甲基胞嘧啶則不被影響;尿嘧啶在後續的聚合酶連鎖反應中,會轉換成胸腺嘧啶(T),可藉由這樣的轉化方式,區別出曾被甲基化的胞嘧啶序列,甚至進一部用定序法偵測 DNA 上的 5-甲基胞嘧啶含量。

近年來,全基因體亞硫酸鹽定序(whole genome bisulfite sequencing, WGBS)成為分析 DNA 甲基化常用的方式,其優點除了容易取得外,更能廣泛涵蓋包括全基因體的甲基化胞嘧啶資訊,以及低 CpG(DNA 甲基化多發生在 CpG 雙核苷酸上)密度區域。目前也多用於大規模、多樣本的甲基化分析中。然而,這種全基因體 DNA 甲基化分析的侷限在於:需取得完整細胞群的 DNA 的前提下,不能分析少數細胞,個別細胞的異質性(heterogeneity)也無法判別。

在 2014 年,Sébastien A Smallwood 等人提出單一細胞亞硫酸鹽定序法(single cell bisulfite sequencing, scBS-seq)[3],除了改良後亞硫酸鹽連結標記(post-bisulfite adaptor tagging, PBAT),讓亞硫酸鹽轉化此一步驟優先執行,使原本因 DNA 降解而造成的訊息損失率降低外,在卵母細胞(M Ⅱ)和小鼠胚胎幹細胞中,能涵蓋 48.4% 的 CpG 位點,並鑑別出甲基化大於基因組平均值的顯著異質性位點,與單一細胞次代表性亞硫酸鹽定序法(single cell reduced-representation bisulfite sequencing, scRRBS)相互對照也有更好的原始序列(raw sequence)回復率。

總結來說,從亞硫酸鹽轉換法的發明,到亞硫酸鹽定序法的逐步改良,結合或互補多種實驗方式,人們對於建立甲基化圖譜,和生物發展初期的細胞甲基化過程有更多的了解!

圖說:(上圖)在相同的細胞培養環境下,利用 scBS-seq 可鑑別出甲基化顯著的異質性 CpG 位點(下圖)相較於 scRRBS,使用 scBS-seq 能有較高的甲基化資訊回復率。

圖片來源:

  1. https://goo.gl/XLdXip(上圖)
  2. https://goo.gl/BH2Qp5(下圖)

參考資料:

  1. Lisa D Moore, Thuc Le, and Guoping Fan. (2013). DNA Methylation and Its Basic Function.Neuropsychopharmacology. 2013 Jan; 38(1): 23–38. Published online 2012 Jul 11. doi: 10.1038/npp.2012.112
  2. Frommer M, McDonald LE, Millar DS, Collis CM, Watt F, Grigg GW, Molloy PL, Paul CL. (1992). A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 Mar 1;89(5):1827-31.
  3. Plongthongkum N, Diep DH, Zhang K. (2014). Advances in the profiling of DNA modifications: cytosine methylation and beyond. Nat Rev Genet. 2014 Oct;15(10):647-61. doi: 10.1038/nrg3772.
  4. Sébastien A Smallwood, Heather J Lee, Christof Angermueller, Felix Krueger, Heba Saadeh, Julian Peat, Simon R Andrews, Oliver Stegle, Wolf Reik, and Gavin Kelsey. (2014). Single-cell genome-wide bisulfite sequencing for assessing epigenetic heterogeneity. Nature Methods volume 11, pages 817–820 (2014). doi: 10.1038/nmeth.3035

撰文吳冠廷
審稿吳畇芸、陳帝亢

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吳冠廷

現為陽明醫學系二年級( 111 級)學生,就讀學碩合一的醫學系 B 組學制;曾領導 2017 年陽明 iGEM 團隊並獲得金牌,重建、主導並規劃 Entropyspace 亂度空間諸多活動與訪談文撰寫,期盼建立一個讓醫學生研究者得以自由交流的平台。目前和朋友做些非生醫領域的 side project、撰寫部落格、學習電腦科學和邏輯學,對生物資訊學和電腦視覺辨識感興趣。希望加入 The Investigator Taiwan 後,能認識不同領域的朋友和高手,讓自己有更多學習跟成長的機會。

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