單一細胞 DNA 甲基化分析方法：全基因體亞硫酸鹽定序

DNA 甲基化（DNA methylation）[1] 是種常見、也是研究最多的表觀遺傳調控方法，透過 DNA 甲基轉移酶（methyltransferase）添加甲基團於胞嘧啶（ C）（或腺嘌呤（ A））上，形成 5-甲基胞嘧啶（5mC），可在不改變 DNA 序列、但改變結構的情況下，調控基因表現；掌握甲基化基因體的實驗方法，對於其作用機制與模式的了解，以及如何應用於作物開發或疾病探索相當重要，本文將介紹亞硫酸鹽轉換（bisulfite-induced modification）和衍生的定序方法―單一細胞亞硫酸鹽定序法（single cell bisulfite sequencing, scBS-seq）等研究方法。

Frommer 等人於 1992 年發表亞硫酸鹽轉換的方式 [2]：未被甲基化的胞嘧啶會被亞硫酸鹽脫氨並轉換為尿嘧啶（ U），5-甲基胞嘧啶則不被影響；尿嘧啶在後續的聚合酶連鎖反應中，會轉換成胸腺嘧啶（T），可藉由這樣的轉化方式，區別出曾被甲基化的胞嘧啶序列，甚至進一部用定序法偵測 DNA 上的 5-甲基胞嘧啶含量。

近年來，全基因體亞硫酸鹽定序（whole genome bisulfite sequencing, WGBS）成為分析 DNA 甲基化常用的方式，其優點除了容易取得外，更能廣泛涵蓋包括全基因體的甲基化胞嘧啶資訊，以及低 CpG（DNA 甲基化多發生在 CpG 雙核苷酸上）密度區域。目前也多用於大規模、多樣本的甲基化分析中。然而，這種全基因體 DNA 甲基化分析的侷限在於：需取得完整細胞群的 DNA 的前提下，不能分析少數細胞，個別細胞的異質性（heterogeneity）也無法判別。

在 2014 年，Sébastien A Smallwood 等人提出單一細胞亞硫酸鹽定序法（single cell bisulfite sequencing, scBS-seq）[3]，除了改良後亞硫酸鹽連結標記（post-bisulfite adaptor tagging, PBAT），讓亞硫酸鹽轉化此一步驟優先執行，使原本因 DNA 降解而造成的訊息損失率降低外，在卵母細胞（M Ⅱ）和小鼠胚胎幹細胞中，能涵蓋 48.4% 的 CpG 位點，並鑑別出甲基化大於基因組平均值的顯著異質性位點，與單一細胞次代表性亞硫酸鹽定序法（single cell reduced-representation bisulfite sequencing, scRRBS）相互對照也有更好的原始序列（raw sequence）回復率。

總結來說，從亞硫酸鹽轉換法的發明，到亞硫酸鹽定序法的逐步改良，結合或互補多種實驗方式，人們對於建立甲基化圖譜，和生物發展初期的細胞甲基化過程有更多的了解！

圖說：（上圖）在相同的細胞培養環境下，利用 scBS-seq 可鑑別出甲基化顯著的異質性 CpG 位點（下圖）相較於 scRRBS，使用 scBS-seq 能有較高的甲基化資訊回復率。

圖片來源：

https://goo.gl/XLdXip（上圖）
https://goo.gl/BH2Qp5（下圖）

參考資料：

Lisa D Moore, Thuc Le, and Guoping Fan. (2013). DNA Methylation and Its Basic Function.Neuropsychopharmacology. 2013 Jan; 38(1): 23–38. Published online 2012 Jul 11. doi: 10.1038/npp.2012.112
Frommer M, McDonald LE, Millar DS, Collis CM, Watt F, Grigg GW, Molloy PL, Paul CL. (1992). A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 Mar 1;89(5):1827-31.
Plongthongkum N, Diep DH, Zhang K. (2014). Advances in the profiling of DNA modifications: cytosine methylation and beyond. Nat Rev Genet. 2014 Oct;15(10):647-61. doi: 10.1038/nrg3772.
Sébastien A Smallwood, Heather J Lee, Christof Angermueller, Felix Krueger, Heba Saadeh, Julian Peat, Simon R Andrews, Oliver Stegle, Wolf Reik, and Gavin Kelsey. (2014). Single-cell genome-wide bisulfite sequencing for assessing epigenetic heterogeneity. Nature Methods volume 11, pages 817–820 (2014). doi: 10.1038/nmeth.3035