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拍攝活體細胞微電影 — 晶格層光顯微術的應用

在 2014 年晶格層光顯微術 (lattice light-sheet microscopy, LLSM) 問世之後,立刻受到科學界的關注,畢竟相較於傳統的生物研究方法,活體生物的高解析度影像仍較為新穎且 LLSM 的低光學毒性以及超高解析度的特性已被認為是拍攝細胞活體影像的利器。在此篇文章當中,我們將介紹 LLSM 在後續生醫研究中的改良及應用。

在 2014 年諾貝爾化學獎得主 Dr. Eric Betzig 在 Science 的論文發表中提及,LLSM 可以用來觀察黏菌 (D. discoideum) 微管的動態 (microtubule dynamics)、細胞分裂 (mitosis)、甚至是 T 細胞與其標的細胞的交互作用。除此之外,更可應用在線蟲 (C. elegans) 以及果蠅的胚胎發育過程。在此篇研究中,作者利用螢光標記了染色體相關蛋白、鈣粘蛋白 (cadherin)、肌動蛋白 (myosin) 以及微管,便可觀察胚胎發育的連續過程,其中包括分子間的交互作用、細胞分裂及分化。[1]

圖1、利用 LLSM 觀察線蟲的胚胎發育 (Chen et al., 2014)

同年,Dr. Eric Betzig 研究團隊結合了 LLSM、單分子追蹤技術 (single-molecule tracking)、數字模擬 (numerical simulations)、以及染色質免疫沉澱法 (ChIP-Exo mapping) 紀錄及功能性追蹤活體胚胎幹細胞中 Sox2 轉錄因子的強化子 (enhancer) 的結構。有了晶格層光單一分子追蹤影像術 (lattice light-sheet single-molecule imaging),作者可以選擇性地定位、追蹤、甚至描繪出內源性 Sox2 的結合位 (binding sites)。此外,更可以去量化 Sox2 結合位在真染色質 (euchromatin) 及異染色質 (heterochromatin) 的空間分布以及去計算 Sox2 強化子群集 (enhancer clustering) 中在真異染色質內的結合模式。綜觀此研究,讓我們更清楚的了解,結合子如何動態調控基因的轉錄。[2]

圖二、利用晶格層光單一分子追蹤影像術在三維空間中定位 Sox2 結合位 (Liu et al., 2014)

2015 年,Dr. Eric Betzig 的研究團隊結合了 LLSM 以及結構光照明顯微術 (structured-illumination microscopy, SIM),改善了 SIM 的解析度並且可以觀察動態細胞的過程影像,包括胞吞作用 (endocytosis) 以及細胞骨架的重塑 (cytoskeleton remodeling)。SIM 是藉由兩道光彼此間互相干涉,照射欲觀測的樣本,因此解析度會較光學顯微鏡高,但可惜受限於光的繞射,因此解析度還不算非常高。但結合了 LLSM 後,可以清楚觀察細胞骨架的動態、粒線體的融合及分裂 (mitochondria fusion and fission)、囊泡運送至高基氏體。每個軸向解析度都比傳統光學顯微鏡還要高五倍之多。[3]

圖三、利用 SIM/LLSM 觀察細胞粒線體內的交互作用 (Li et al., 2015)

在 2018 年,Dr. Eric Betzig 的研究團隊將 LLSM 與調適光學 (adaptive optics, AO) 做結合,研究多種次細胞的突起 (subcellular processes)。調適光學原本是天文學家為了觀測遙遠星體時,用來克服大氣抖動對於成像影響的策略。當光穿透過不同組織時,會產生 3D 的像差,這會導致成像問題,因此 AO 在此扮演了校正像差的角色。在這篇研究當中,作者以斑馬魚做為模型,觀察到了免疫細胞通過斑馬魚的內耳、脊髓神經的迴路、以及癌細胞爬行。雖然在三維空間的多細胞環境讓顯微鏡成像有相當高的難度,但有 AO 的幫忙,顯著提高了整個成像的清晰度,因此可以進一步窺探組織內的細胞成像。

圖四、斑馬魚細胞在三維空間的遷移 (Liu et al., 2018)

在今年一月中,Dr. Eric Betzig 與任教於麻省理工學院的神經學家 Dr. Ed Boyden 聯手在 Science 發表了有關果蠅全腦神經地圖的論文。他們將 LLSM 及擴展顯微術 (expansion microscopy) 做結合,建構出超高解析度的果蠅全腦神經的所有細節!其中包含約四千萬個神經突觸,也可看到其在大腦不同區域的分布,並精確定位各個神經元。因此如果可以利用這項技術去拼湊神經病變的病人中的大腦地圖,知道疾病如何發展,將對治療非常有助益 [5]。

圖五、分析老鼠大腦視覺皮質中的神經及髓鞘形成 (Gao et al., 2019)

總結來說,LLSM 在生物醫學領域的研究中展現出它驚人的潛力,並且透過和不同的技術結合增加這個技術的長處並修正其弱點,未來也期待 Dr. Eric Betzig 團隊新的突破及技術的普及化,使我們能更進一步地探究細胞世界的全貌,並應用於疾病治療。

圖6、晶格層光顯微鏡的一瞥 (網絡來源:https://www.janelia.org/archive/lattice-light-sheet-microscope)

參考文獻

  1. Chen, B.-C., Legant, W. R., Wang, K., Shao, L., Milkie, D. E., Davidson, M. W., … Betzig, E. (2014). Lattice Light Sheet Microscopy: Imaging Molecules to Embryos at High Spatiotemporal Resolution. Science (New York, N.Y.), 346(6208), 1257998. doi: 10.1126/science.1257998.
  2. Liu, Z., Legant, W. R., Chen, B. C., Li, L., Grimm, J. B., Lavis, L. D., … & Tjian, R. (2014). 3D imaging of Sox2 enhancer clusters in embryonic stem cells. Elife, 3, e04236.
  3. Li, D., Shao, L., Chen, B. C., Zhang, X., Zhang, M., Moses, B., … &Betzig, E. (2015). Extended-resolution structured illumination imaging of endocytic and cytoskeletal dynamics. Science, 349(6251), aab3500.
  4. Liu, T. L., Upadhyayula, S., Milkie, D. E., Singh, V., Wang, K., Swinburne, I. A., … & Betzig, E. (2018). Observing the cell in its native state: Imaging subcellular dynamics in multicellular organisms. Science, 360(6386), eaaq1392.
  5. Gao, R., & Betzig, E. (2019). Cortical Column and Whole Brain Imaging of Neural Circuits with Molecular Contrast and Nanoscale Resolution. Science, 360(6424).

撰文|蕭皓文
審稿|林偉強

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蕭皓文

蕭皓文

目前在中研院生醫所做免疫療法的相關研究,也正準備申請國外的生醫博士班。

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