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主題回顧 — 第三代定序

       現代定序技術在各個平台的較勁之下迅速演進,從一開始的 Sanger sequencing 到第三代定序,定序 (sequencing) 儼然成為了顯學,而不同平台所使用的技術原理也每每讓我們驚艷於研發者的創意;然而,定序真的是一切的解決之道嗎?第二、三代定序發展至今又遇到了什麼困境?以下就讓我們回顧在 2018 年 11 月的第三代定序專題中,介紹的多種第三代定序技術及臨床應用。

       相較於第二代定序使用的方法是利用 PCR 擴增樣本後,將 DNA 切碎成小於 500 bp 的短片段進行大量平行定序,第三代定序則是直接對原始 DNA 樣本進行單分子定序,由於採取的策略是盡量不把 DNA 切碎,因此定序片段相對較長,通常大於 10000 bp,可以解決第二代定序在高度重複序列易有組裝上錯誤的缺點,同時也減少因為 PCR 擴增所產生的錯誤率及偏好性;但第三代定序也因低通量,而帶來高成本和定序錯誤率高的問題。綜合上述,可以知道第二代和第三代定序各有優缺點,因此在第三代定序技術發展的同時,雖然還不能完全取代第二代定序,但能夠增加研究者做研究以及未來疾病診斷的選擇。

       以下將為大家回顧三種主要的第三代定序技術,第一種是 Helicos Biosciences 的單分子螢光定序法 (single molecule fluorescence sequencing),原理是將 DNA 打碎成 200 bp 大小的片段,被接到 DNA 片段末端的 Poly-A 和晶片上的 Poly-T 結合後,再分次加入有螢光標記的不同 dNTP,進行定序,由於不需要透過 PCR 擴增,也可進行 RNA 直接測序 [1]。 第二種是 Pacific Biosciences 的單分子即時定序法 (single molecule real time sequencing, SMRT),原理相同,不同的是仰賴於每個小孔洞僅能容納單一 DNA 及 DNA 聚合酶的技術進行,定序片段較長,且具有定序時間短的優勢,能在 DNA 聚合酶失去活性前完成定序,然而隨機錯誤率略高,目前已透過形成環狀 DNA 以重複定序來解決 [2]。 第三種是 Oxford Nanopore Technology 的奈米孔定序法 (nanopore sequencing),由於膜的兩端有電位差,當單股 DNA 上的不同鹼基通過跨膜蛋白時,會產生不同大小的電流,進而達到即時定序的目的,雖然具有因樣本處理簡單而低成本的優點,然而如何使 DNA 通過孔洞的速度變慢,以提高準確率仍有待改進 [3, 4]。

       由於第三代定序技術可以對原始 DNA 樣本進行長片段定序的特性,可進行不依賴參考基因組 (reference genome) 的 de novo sequencing,有望補足人類基因體計畫在重複序列及缺失片段尚未被定序出來的部分 [5]。同時,第三代定序能夠即時定序的優點,可根據遲滯時間,來回推 DNA 上具有表觀遺傳標記和 DNA 損壞時的化學標記,為表觀遺傳學的進一步研究帶來一線曙光 [6]。 另外,在臨床方面,第三代定序技術有望應用於診斷因過度重複序列造成的疾病,例如:X 染色體脆折症,以及更準確地擬定精準醫療的治療策略 [7]。 接下來,第三代定序技術會如何演進,以及不同技術平台之間又會擦出什麼火花,就讓我們拭目以待吧!

圖片說明:第三代定序相較於第二代定序具有讀長(read length)較長的優勢。圖片來源:This work is a derivative of “developments in NGS” by Lex Nederbragt, used under CC BY 4.0.

參考文獻:

  1. 第三代定序 — Helicos 技術及原理 https://investigator.tw/7039/
  2. 第三代定序 — SMRT 技術及原理 https://investigator.tw/7007/
  3. 第三代定序 — Oxford nanopore 技術及原理 https://investigator.tw/7083/
  4. 基因測序的技術研發及發展趨勢 http://www.libnet.sh.cn:82/
  5. De novo assembly — 人類基因體補完計畫 https://investigator.tw/1185/
  6. 第三代定序:定出 DNA 表觀遺傳標記 https://investigator.tw/7116/
  7. 第三代定序於臨床醫學上的應用 https://investigator.tw/7142/
  8. RNA定序的突破 — RNA高度平行直接定序法 https://investigator.tw/7132/

撰文|李亞芸
審稿|邱亮源

About the author

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李亞芸

目前就讀台大醫學院微生物暨免疫所碩士一年級,研究領域為細胞衰老(senescence)在發炎及腫瘤形成的為環境中所扮演的角色。對生醫領域的研究抱持著熱情,期許加入Investigator in Taiwan繼續吸收新知、增進自己,以及和大家一起交流、努力推廣生醫研究的有趣之處。

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