有效率的訊息傳遞,對於生物調控自身的基因表現是非常重要的,但窺探其機制經常牽涉到資訊的本身與雜訊的干擾。因此,美國馬里蘭大學的 William E. Bentley 教授團隊建立一套可調控電誘導性 CRISPR(electrogenetic clustered regularly interspaced short palindromic repeats, eCRISPR)系統,將電子訊號轉化成生物可讀訊息。此團隊已於 2016 年建立一套以氧化還原(reduction and oxidation, redox)為基礎的電子訊息轉換裝置,藉由外部給予細菌間的抗菌素(pyocyanin,PYO)與外加電壓使大腸桿菌(E. coli)內的氧化壓力(oxidative stress)增加,而啟動調節蛋白 SoxR(SoxR regulator)進而表現有興趣之基因,如:綠螢光蛋白(phiLOV)[1]。在 2013 年,Marraffini 教授團隊發現若是針對 CRISPR 系統的 Cas9 進行修飾並接上 RNA 聚合酶的 ⍵ 次單元(deactivated Cas9-⍵,dCas9-⍵)會使 Cas9 喪失其剪切功能並轉而啟動目標基因的轉錄發生 [2]。另一篇 2017 年研究指出,E. coli 內部的 dCas9 失活剪切酶裝載針對 W108 序列進行結合的 gRNA,則可以增加 CRISPR-dCas9 複合物對於轉錄起始點(transcriptional start site ,TSS)上游的親和力,進而增加其下游基因的表現 [3]。William E. Bentley 教授團隊結合了前人的文獻與自身的研究,開發一套富有可利用電訊號調控的 eCRISPR 系統。
作者利用氧化的 PYO(PYO [O])作為氧化還原的誘導劑(inducer)以及 ferricyanide (Fcn)/電極作為氧化還原訊號放大劑(amplifier)。隨著 E. coli 內的氧化壓力越大,guide RNA (gRNA)表現也會隨之增加,這些 gRNA 與 dCas9-⍵ 組裝後開始啟動 GFP(phiLOV)的表現(圖一 a)。隨著電極給予的電量增加,可觀察到 GFP 的表現增加,但在電量超過 -0.5 庫倫時會產生太強的氧化壓力毒性導致 GFP 表現下降(圖一 b)。給予 -0.4 庫倫的電量後培養四小時,則可以使 E. coli 表現最多的 GFP,培養超過四小時則可能因細胞進入停滯期(stationary phase)使 GFP 表現量下降(圖一 c)。除了 E. coli 內部的基因表現增加,作者也探討 eCRISPR 系統是否可以調控細菌間的溝通(quorum sensing,QS)。LasI (QS autoinducer-1 synthase)是一種不存在於 E. coli 的酵素,導入其基因進入 E. coli 後可以使其產生 autoinducer-1(AI-1),作為 AI-1 製造者(producer cell),E. coli 若是接受越多的電量,會產生更多的 AI-1;這些 AI-1 會促使 AI-1 接受者(reporter cell)產生生物冷光,經由換算,當電量給予 -0.06~-0.1 庫倫之間,最終 AI-1 表現量會有約 1.5 倍的上升(圖一 d),說明藉由 eCRISPR 系統可以開啟細菌本身不具有的基因迴路。綜合上述結果,以電極調控 CRISPR 系統是可以調控細菌內部的基因表達與細菌間的訊息傳遞。
E. coli 的基因組(genome)對於過度的氧化環境會有相對應的措施,藉由啟動 SoxR regulator 產生 SoxS 蛋白進而表現一系列抗自由基(reactive oxygen species,ROS)基因如:超氧化物歧化酶(SOD)。因此作者設計兩個 gRNA 可以辨認 SoxS promoter 下游的位置(S1 與 S2 gRNA),預期可以阻斷 SoxS 表現。從實驗結果發現,無論是使用一般的 dCas9 還是 dCas9-⍵ 都可以發揮 CRISPR inhibition 效果,相較於無特定序列的 gRNA(control gRNA),S1 與 S2 gRNA 皆可以抑制 SoxS 表現(圖二 a)。當 S1 gRNA 表現時,因為 soxS 蛋白表現受到抑制以至於其調控的的抗自由基酵素也無法被表達,因此使外加的氧化壓力無法被胞內抗氧化機制消除而大量提高 GFP 的表現,也說明了 S1 gRNA 有緘默 SoxS 表現的能力(圖二 b)。
綜合上述實驗結果,透過誘導劑(PYO [O])以及放大劑(Fcn/電極)可以像開關一樣打開/關閉 gRNA 表現,而影響 dCas9-⍵ 的活性,進而決定多個基因是否同時表現或被抑制。由於 E. coli 會表現抗氧化基因以抑制氧化壓力,作者藉由插入一個 S1 gRNA 來緘默基因組的抗氧化基因,達到放大訊號的目的(圖三)。因此作者認為此 eCRISPR 系統旨在連接和控制生物傳訊網絡,並在合成生物學、生物技術和生物醫學等領域具有潛在應用,如:針對腸道菌叢設計含有可抑制 QS 的 eCRISPR 啟動子以及氧化還原化合物的電子膠囊,也許可以對腸道菌叢進行調節,避免腸道微生態失調(dysbiosis)的發炎情況 [4, 5]。此外氧化還原所建立的電子通道,或許也能應用到真核細胞中,如:藉由癌症所處的高氧化壓力環境 [6],判斷電子的流向來開發癌症診斷的儀器或者是抗癌藥物,將基礎原理應用到更廣泛的層面上。
Main Article: Bhokisham, N., VanArsdale, E., Stephens, K. T., Hauk, P., Payne, G. F., & Bentley, W. E. (2020). A redox-based electrogenetic CRISPR system to connect with and control biological information networks. Nature communications, 11(1), 2427. https://doi.org/10.1038/s41467-020-16249-x
參考文獻:
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撰文|林裕祥
審稿|王曼軒、張智婷