人類 DNA 中約莫有 400 個基因的蛋白產物是離子通道（ion channels）的次單元（subunits），細胞膜上的離子通道具有依循著電化學梯度（electrochemical gradient）加速離子被動運輸（passive transportation）通過雙層磷脂質的功能，也能作為細胞與外在環境之間的守門員，管控各種離子的流通，使細胞內的離子濃度能維持在正常生理狀態下，更貼切的比喻就像每個國家的海關，管控人口出入的流量以及嚴格的審查。而每種離子通道的開關（gating）、通透性（permeation）存在著多樣性，還可能受到其他訊息分子的調控。
在離子通道的研究中，有幾個關鍵的問題，當我們對於特定的離子通道蛋白有興趣時，我們首先會想問：（1）屬於蛋白質複合體（complex）的離子通道如何運作？（2）他們在生理上扮演的角色？（3）他們如何被調控？（4）當這些離子通道有所缺陷時，會產生何種疾病？而有哪些方法能協助我們釐清這些問題？在此，我們整理了許多離子通道工程技術（ion channel engineering approaches）在上述研究中的角色，方便我們更清楚瞭解這些分子的基本架構和運作機制，在細胞生理上扮演的角色（physiological role），以及當它們的功能失常時（dysfunction），可能會導致多種疾病（通稱為 Channelopathy）。
要了解結構與通道功能間的關係，最簡單直接的方法就是對特定胺基酸進行點突變（single residue mutagenesis），能夠讓我們了解胺基酸是否對於離子通道功能是重要的，而此時科學家們就有二個重要的因素需要考慮：（1）要對哪個胺基酸位點進行突變、（2）應突變成何種胺基酸。在挑選突變位點時，我們可以找尋同一類蛋白中高度保守的位點，例如：電位閘控（型）（voltage-gated） 的 NaV、 KV、 CaV 通道在電訊號偵測（voltage sensor）的片段（segment）有較多的帶正電胺基酸，因此當我們進行點突變使這個區域的電荷中和，此時離子通道就不再依賴電訊號才能開啟。
而要突變成何種胺基酸有很多選擇，例如研究相關離子通道所造成的疾病，則可突變成病人中常見的突變胺基酸；若認為通道功能與磷酸化有關則可突變成模擬磷酸化的胺基酸（aspartate、 glutamate）或者去磷酸化（alanine）。而由於自然界常見的 20 種胺基酸之間的差異通常不只一種，例如大小、帶電荷、官能基同時有 2 個以上的相異處，會導致結果判斷上須考量的因素複雜許多，而且傳統的點突變方法無法改變蛋白的骨架（backbone），因此我們可透過合成胺基酸（unnatural amino acids）來取代，有 2 種方法—（1）in vivo nonsense suppression（2） ion channel semisynthesis。除此之外，突變成胱胺酸（cysteine）（稱為 substituted cysteine methods）可讓我們推論某胺基酸片段是否位在通道開口，這是因為胱胺酸帶有硫氫基（thiol group），當突變成功後，若加入會與這些基團進行反應的親水性試劑後，會影響到離子的通透性，則該區域便很有可能是通道閘門的位置。另外，文章中還提到其他的一些技術包括嵌合體通道分析（chimeric channel analyses），讓我們對於通道蛋白中各個區域（domain）負責的功能更加清楚；螢光標定蛋白研究離子通道的運輸，協助我們了解離子通道在細胞膜表現的密度。
要探討離子通道實際在生物體中的生理角色，勢必得考量可興奮性（excitable）細胞如心肌和神經細胞，它們在結構與環境間的複雜性。離子通道工程設計的離子通道，此時便成了偵測細胞生理狀態時最好的生物感知器（biosensor）。它們可以捕捉到由於高度集中且只有毫秒關鍵，即便在高解析影像下仍舊無法精準偵測到得離子訊號變化。作者在文章中提到透過嵌合體離子通道可以作為感知鈣離子通道旁鈣離子與鈣離子調控蛋白 CaM（calmodulin）濃度的偵測器，甚至是後續膜電位的改變。舉例來說，由於 CaV 1.2 通道易受到 Ca2+ 回饋的抑制（Calcium-dependent inactivation， CDI），且這樣得抑制受栓在鈣通道 C 端 (C-terminus）的 CaM 濃度所調節，因此當我們將將不敏感的突變種（CaM1234）以 polyglycine 鏈接合到通道上時，CDI 的特性便會消失，然而，當增加 polyglycine 的長度後會降低 CaM1234 的濃度，且同時被提高的內生性（endogenous）CaM 競爭取代，回復 CDI。如此系統的設計便能透過 polyglycine 的鏈結長度對應 CDI 的效率，推算出離子通道旁相關調節蛋白的濃度。
此外，動物模型也讓我們能更直接探討離子通道在活體的生理功能，如基因植入小鼠模型（knockin mice model）已經幫我們了解了許多離子通道缺陷導致的病變其致病機轉和病理表現情形，舉例來說:家族性偏癱性偏頭痛（familial hemiplegic migraine）病患中 ， CaV2.1 的突變為造成此疾病的原因之一。
本篇文章著重於電位閘控離子通道的工程技術的介紹及其應用，包括對通道功能的研究策略，合成離子通道作為生物探針（probe），以及離子通道模組化元件（modulator）的建立。此外，也揭示了物理學的策略應用於生物學探討的強大之處，同時也拜電腦科技進步之賜，我們對於離子通道運作的模擬可以更加以精確。未來領域中還有許多更有效，專一性更高的工程技術等待科學家去開發，讓我們有機會對離子通道有更深一層的認識。
圖片來源：doi: 10.1016/j.jmb.2014.09.001
參考資料：
- Subramanyam, P., & Colecraft, H. M. (2015). Ion Channel Engineering: Perspectives and Strategies. Journal of Molecular Biology, 427(1), 190–204. doi: 10.1016/j.jmb.2014.09.001
- Ben-Johny, M., & Yue, D. T. (2014). Calmodulin regulation (calmodulation) of voltage-gated calcium channels. The Journal of General Physiology, 143(6), 679–692. doi: 10.1085/jgp.201311153
