突觸內的大千世界：視覺化囊泡運輸相關蛋白的分佈及含量

突觸的囊泡循環（vesicle recycling）對於研究細胞內物質運輸（cellular trafficking）機制來說是個經典的模型。在突觸中，參與鈣離子調控的囊泡胞吐作用之關鍵蛋白，如 SNAREs, synaptotagmins, complexins，其結構與功能的研究已經累積豐富並具有生物意義的知識。即便該議題在過去幾年非常熱門，但視角仍都處於微觀面，在生物體裏分子作用效率的執行面，像是這些關鍵蛋白在突觸中是以何種形式分佈？以及其數量的比例多寡，如何使得突觸中囊泡的分泌得以維持高效能，尚未有著直觀的數據及模型支持。2014 年五月，由哥廷根大學醫學中心 Rizzoli Silvior 教授所領導的團隊結合了定量免疫染色法（quantitative immunoblotting）以及質譜儀定出特定蛋白在突觸中的含量，搭配先進的超高解析顯微法（super resolution fluorescence microscopy）找出特定蛋白在突觸中的分佈形式，最後，根據這些數據建立了內含三十萬個蛋白質的三維突觸模型（圖A）。

[具有細緻調控的突觸囊泡循環]

突觸內囊泡的循環裡，游離在突觸的囊泡利用 SNARE（soluble NSF（N-ethylmaleimide-sensitive factor）Attachment protein Receptor）相關蛋白黏附（docking）到活化區（Active Zone）後，待鈣離子通道產生鈣離子的淨通量（influx）後，位於釋放裝置上（release appartus）的鈣離子偵測蛋白會立即感應，並促成融合作用（fusion）釋放神經傳導物質（exocytosis）。另一方面，胞飲作用（endocytosis）會藉由具有 SH3 domain 的蛋白引導，例如 Amphiphysin 將  Dynamin 帶到胞飲區掐入形成新的囊泡（圖B）。簡而言之，完成一個囊泡循環需要許多蛋白質的通力合作（參考資料1, 2）。

[單一突觸體內平均特定運輸蛋白的總量及分布]

團隊將取自鼠腦的均質液（homogenate）離心取突觸體（synaptosome）層，利用定量免疫染色，計算出得到每公克突觸體裡面特定蛋白的重量。同時染突觸體外膜，利用螢光顯微鏡計算每公克突觸體的數量。兩者相除便會得到特定蛋白在一個突觸體中“平均”個數（copy number）。但特定蛋白究竟在突觸裡面是以何種形式分佈呢？多虧有了突破繞射極限的超高解析顯微法（注一），團隊利用受激放射顯微法 STED（STimulated Emission Depletion），將六十二種蛋白分別進行免疫染色，發現某些蛋白分佈採用的是人海戰術，例如 amphiphysin 四散在整個突觸中。另外某些蛋白則是具有區域專一性，例如 Rab3，與突觸囊泡的分佈呈正相關，或像是 SNARE 相關蛋白 syntaxin 1，其分佈趨勢集中於突觸的活化區（圖C）。最後團隊結合了定量及蛋白分佈區的數據，利用已知的蛋白結構，模擬出分子層級的單一突觸的模型（圖A）。

對於身攬神經元間彼此溝通重任的突觸來說，此篇研究細緻地以分子層級，為人們呈現了蛋白在“平均”突觸中趨於真實分佈的樣貌。在許多苦工的巨量投資以及最先進的技術堆砌下，此篇研究成果揭示了單一蛋白在神經元內部的運轉情況，並提供給科學家們絕佳的詮釋素材。

 

參考資料：

1. Haucke, V., Neher, E., & Sigrist, S. J. (2011). Protein scaffolds in the coupling of synaptic exocytosis and endocytosis. Nature Reviews Neuroscience, 12(3), 127-138. doi:10.1038/nrn2948
2. Jahn, R., & Fasshauer, D. (2012). Molecular machines governing exocytosis of synaptic vesicles. Nature, 490(7419), 201-207. doi:10.1038/nature11320
3. 【2014諾貝爾化學獎深入報導】 打破光學顯微鏡的解析度極限-超高解析螢光顯微法 | 科學Online. (n.d.). Retrieved from http://highscope.ch.ntu.edu.tw/wordpress/?p=58742

撰稿｜邱亮源

修訂｜林映希