雙光子雷射掃描顯微術 （Two-photon excitation laser scanning microscopy）在 1990 年時由 Denk 領導的團隊所打造，其利用了一個特性：螢光分子在躍遷至激發態時，所需的能量可以被兩個能量較小的光子在近乎同時間撞擊到螢光分子的情況下提供。這樣的顯微術讓我們能用波長較長的紅光以及遠紅光來激發組織深處的螢光分子，由於波長較長的光在穿透組織時較不容易散射掉，這樣的顯微術可被用來觀測活體動物的組織，這幾年已變成研究腦內神經活動的重要工具之一 [2]。
由於雙光子顯微術的光只會聚集在焦點上，在成像時必須將樣本劃分成一塊塊微小的方格，以高速掃描的方式來取得每個方格的影像，現在的掃描技術在一個 2D 的平面上掃描是綽綽有餘。雖然使用口徑較大的物鏡得以觀測大規模的神經活動 [3]，但是神經細胞迴路往往不是分佈於同一個平面上，因此想要得到不同深度的訊號只能來回移動物鏡及焦點或是拉長焦距，但這些都有它的極限。
這篇論文主要是在介紹如何使用兩道的雷射光以一個 V 型或類似梯形的方式來得知不同深度的螢光訊息（volumetric two-photon imaging of neurons using stereoscopy, vTwINS）。當掃描不同深度的物體時，Tank 的團隊先以兩道光分別激發到物體上來取得兩道光各自激發到物體時的平面距離，利用相似三角形的概念來推算出其相對深度，也就是說兩道雷射光在越近的距離時激發到的物體其深度會相較於較遠的地方激發到的物體來得深。透過這些技術與演算方法的改革，Tank 的團隊在觀察大腦視覺皮質的神經活動時，因為能把非焦平面上的訊號也定位出來，比起單一平面所能觀察到的細胞數，vTwINS 可以觀察到接近三倍多的細胞數。
除了單一神經細胞活動的操控，近幾年在神經科學中有很多技術上的突破，不管是顯微鏡學的突破 [3,4] 還是電生理學測量儀器的進步 [5]，這些新的發明使得我們可以同時觀察到上百甚至上千個神經元的活動，讓我們能夠更精確地解碼神經細胞們所傳遞的訊息。
參考資料：
- Song, A., Charles, A. S., Koay, S. A., Gauthier, J. L., Thiberge, S. Y., Pillow, J. W., & Tank, D. W. (2017). Volumetric two-photon imaging of neurons using stereoscopy (vTwINS). Nature Methods, 14(4), 420-426. doi:10.1038/nmeth.4226
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., & Webb, W. W. (2003). Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology, 21(11), 1369-1377. doi:10.1038/nbt899
- Sofroniew, N. J., Flickinger, D., King, J., & Svoboda, K. (2016). A large field of view two-photon mesoscope with subcellular resolution for in vivo imaging. doi:10.1101/055947
- Ahrens, M.B., Orger, M. B., Robson, D. N., Li, J. M., & Keller, P. J. (2013). Whole-brain functional imaging at cellular resolution using light-sheet microscopy. Nature Methods, 10, 413–420. dx.doi.org/10.1038/nmeth.2434
- Jun, J. J., Steinmetz, N. A., Siegle, J. H., Denman, D. J., Bauza, M., Barbarits, B., … Harris, T. D. (2017). Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity. Nature,551(7679), 232-236. doi:10.1038/nature24636
撰文｜李其育
編輯｜紀威佑
